生物检测

重组蛋白是生物制药的核心成分（如单抗、细胞因子），其分离鉴定的准确性直接关乎药品安全性、有效性与质量可控性。三方检测作为独立于药企与监管机构的专业服务，通过标准化流程实现定性（确认分子身份）与定量（精准测定含量）分析，是药品研发、注册及生产中不可或缺的质量保障环节。本文将系统拆解生物制药重组蛋白分离鉴定的定性定量三方检测服务全流程，明确各环节的技术要点与合规要求。

样本接收与合规性核查

三方检测的首步、样本接收与合规核查：需确认样本名称、批号、保存条件（如-80℃冻存需验证运输温度链未断裂）、外观状态（无浑浊、沉淀），同时核对委托方提供的资料（如表达系统、纯化工艺、目标蛋白分子量/等电点）是否符合GLP/GMP要求。

若样本存在异常（如反复冻融痕迹、标签模糊），需立即联系委托方确认，必要时拒绝接收——重组蛋白易受温度、pH影响降解，样本完整性是检测准确性的前提。接收后用二维码唯一标识，录入实验室信息管理系统（LIMS），确保全流程可追溯。

样本前处理需匹配蛋白特性：包涵体表达的蛋白用梯度尿素溶液复性；分泌型蛋白通过离心（12000rpm，10min）去除细胞碎片，或用0.22μm滤膜除菌。前处理参数（如离心时间、滤膜型号）需详细记录，避免人为误差。

前处理后快速测定浓度（如UV280分光光度法），确保符合后续实验要求（如SDS-PAGE需1-5μg/μL）。浓度不足用超滤浓缩，过高则用相同缓冲液稀释。

分离技术的选择与实施

重组蛋白分离的核心是去除杂质（HCP、DNA、聚集体）、富集目标蛋白，技术选择需匹配理化特性：按分子量分离选SDS-PAGE（变性条件使蛋白带均匀负电，凝胶中按大小迁移）；需保持天然构象（如测活性）选Native-PAGE（无SDS与还原剂，依分子量、电荷分离）。

高纯度样本（如用于质谱分析）需用层析组合：先用离子交换层析（IEX）去除大部分HCP（如目标蛋白pI=8.0，pH7.0下结合阳离子柱，NaCl梯度洗脱）；再用尺寸排阻层析（SEC）去除聚集体（选分离范围10-600kDa的柱，流动相为PBS）；最后用反相层析（RP）进一步纯化（C18柱，乙腈梯度洗脱），得到纯度≥98%的样本。

分离过程需中间质控：SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统分析条带纯度（目标条带占比≥95%视为合格）；层析时监测UV280吸光度，收集目标峰并通过Western Blot验证，确认含目标蛋白。

分离后样本需立即用于后续检测，或-80℃短期保存（避免反复冻融）。长期保存需添加10%甘油保护，防止蛋白变性。

杂质分析：分离后的关键核查

分离后需验证杂质是否去除达标：HCP用ELISA检测（多克隆抗体夹心模式，OD450值比对标准曲线，≤100ppm符合ICH Q6B要求）；DNA用qPCR检测（宿主细胞特异性引物扩增，≤10ng/dose符合FDA规定）。

蛋白聚集体用SEC-HPLC检测：峰面积占比≤1%（单抗类药物），若超出需调整分离条件（如延长SEC柱洗脱时间、更换高柱效层析柱）。

杂质含量超标的样本需重新分离：例如调整离子交换层析的NaCl梯度斜率，或增加SEC柱的上样体积，直至杂质含量符合要求。

杂质样本需妥善保存（-20℃），供委托方复核，确保数据可追溯。

定性鉴定：分子身份的确认

定性鉴定需多技术交叉验证分子身份：首先用Western Blot初筛——分离后的蛋白转移至PVDF膜，用目标蛋白特异性抗体孵育，ECL发光检测，条带位置与目标分子量一致则初筛通过。

再用质谱精准验证：MALDI-TOF测定准确分子量（误差≤0.1%），与理论分子量（氨基酸序列计算）比对，确认分子完整性；LC-MS/MS进行肽图分析——蛋白经胰蛋白酶酶解为肽段，测定序列并与理论肽图比对，覆盖率≥90%视为准确。

还可通过等电聚焦电泳（IEF）确认电荷一致性：蛋白在pH梯度凝胶中迁移至等电点（pI）位置，染色后条带位置与理论pI（如重组人胰岛素pI=5.4）一致，验证电荷属性。

定性结果需一致：若Western Blot有条带但质谱分子量偏差>0.5%，需回溯分离过程或核对委托方提供的氨基酸序列。

定量分析：含量与纯度的测定

定量分析需测定目标蛋白含量与杂质占比，方法选择需合规：UV分光光度法快速筛查——利用蛋白在280nm的特征吸收，通过比尔定律计算浓度，适用于高纯度样本（杂质吸收可忽略）。

ELISA法灵敏度高——夹心模式结合目标蛋白，TMB显色后测OD450值，比对标准曲线计算含量，检测限可达ng/mL级，适用于低浓度或杂质干扰多的样本。

HPLC是法规推荐方法——反相HPLC（C18柱，乙腈梯度洗脱）用外标法计算目标蛋白含量；SEC-HPLC通过峰面积占比测定聚集体纯度（单抗聚集体≤1%）。

定量需方法学验证：线性关系R²≥0.99，精密度RSD≤5%，准确性回收率90%-110%，确保结果可靠。

交叉验证与质量控制

三方检测的核心是独立客观性，需通过交叉验证确保结果可靠：定量分析用ELISA与HPLC同测同一指标，结果偏差≤10%视为一致；定性鉴定用Western Blot与质谱同验，确保分子身份无误。

内部质控贯穿全程：每批检测设置阳性对照（已知浓度标准品）与阴性对照（无目标蛋白缓冲液），验证实验体系有效性（阳性条带清晰、阴性无信号）。

仪器需定期校准：HPLC每月校准泵压力、流速；质谱每次实验前用标准品校准分子量，确保性能稳定。

异常结果需溯源调查：先核查样本前处理（如稀释错误），再检查仪器状态（如HPLC柱失效），最后重新实验——所有过程记录于LIMS系统，确保可追溯。

报告生成与数据交付

检测完成后生成标准化报告，内容包括：委托方信息、样本信息、检测方法（如SDS-PAGE的凝胶浓度、电泳时间）、结果（定性条带位置、质谱分子量；定量含量、杂质占比）、结论（是否符合委托方质量标准或法规要求）。

报告需符合国际法规要求（如ICH Q2、FDA生物制品质量控制指南），所有数据可溯源（每个结果对应LIMS中的实验记录），并由授权签字人（如实验室负责人）审核签字。

数据交付方式与委托方确认：提供电子报告（PDF格式，带电子签名）与纸质报告（盖章），同时可提供原始数据（如HPLC色谱图、质谱谱图）供复核。

若需海外注册，可提前沟通提供英文报告，确保符合目标市场的法规要求（如EMA、PMDA）。