生物检测

生物样本库中，蛋白质分离鉴定的长期存储检测是保障样本生物学价值与数据可靠性的核心环节。其服务流程需兼顾样本稳定性、分离准确性与结果可追溯性，通过标准化步骤实现从样本接收至报告输出的全链条质控。本文将拆解该流程的关键环节，明确各步骤的操作规范与技术要点。

样本接收与信息录入

样本接收是流程起点，需严格核对样本类型（组织、血液、细胞悬液等）、供体信息（ID、采集时间）及历史存储记录（冻融次数、温度波动）。外观检查需排除溶血、浑浊、容器破损等异常，不合格样本直接拒收，避免后续检测偏差。

信息录入依托实验室信息管理系统（LIMS），为每个样本分配唯一标识（条形码/二维码），录入内容包括蛋白质初始属性（浓度、纯度、溶解度）、采集时处理方式（如是否加抗凝剂）。所有信息需双人核对，确保与实物一致，为后续追溯奠定基础。

蛋白质预分离前处理

前处理核心是保护蛋白质完整性。样本解冻需在4℃缓慢进行，避免冰晶破坏蛋白结构；裂解步骤根据样本类型选裂解液（组织用RIPA、细胞用NP-40），并加蛋白酶/磷酸酶抑制剂（PMSF、EDTA）抑制降解。

裂解后经12000g、4℃离心15分钟取上清，用BCA或Bradford法定量（浓度误差≤5%）。随后分装为50-100μL aliquots，避免反复冻融，每个aliquot标注用途（如“分离用”），确保后续操作的一致性。

长期存储条件验证

存储条件需根据蛋白质特性验证：选择存储介质（-80℃冰箱或液氮气相），模拟1-12个月存储周期，检测蛋白完整性（SDS-PAGE条带连续性）、活性（酶类催化效率）与溶解度（是否沉淀）。

验证需设新鲜样本对照，对比存储后与初始状态差异。例如，热敏感激酶类蛋白，液氮存储1年的完整性优于-80℃；结构稳定的白蛋白，-80℃存储1年仍保持95%以上活性。验证结果作为后续存储的依据。

蛋白质分离方法选择与实施

分离方法基于目标蛋白特性：分子量差异选凝胶过滤层析，电荷差异选离子交换层析，特异性结合选亲和层析（His-tag蛋白用镍柱），复杂样本选双向电泳（等电点+分子量双重分离）。

实施时需控制参数：层析柱用5倍柱体积缓冲液平衡，流速保持线性（如1mL/min）；双向电泳中，IPG胶条根据等电点范围选择（pH3-10覆盖大部分蛋白），聚焦时间需12小时确保蛋白充分分离。

分离后的fractions用10kDa超滤管浓缩至100-200μL，便于后续鉴定。每个fraction标注分离条件（如“离子交换pH7.4”），避免混淆。

鉴定前质量控制

分离后样本需三重质控：纯度用HPLC或SDS-PAGE（≥90%），完整性用Western blot（目标蛋白条带单一、无降解），浓度用NanoDrop定量（质谱上样量1-5μg）。

杂质去除是关键：用脱盐柱去除去污剂、盐离子（如SDS、NaCl），避免干扰质谱离子化；若有角蛋白污染，需做空白对照（仅加裂解液），确保结果可靠。

质谱鉴定与数据解析

质谱类型匹配样本复杂度：复杂样本用LC-MS/MS（液相色谱串联质谱，分离肽段后测序），简单样本用MALDI-TOF/TOF（适合纯化后单一蛋白）。

样本制备需经还原烷基化（DTT开二硫键、碘乙酰胺烷基化）、胰蛋白酶酶解（37℃过夜），将蛋白切成3-20氨基酸肽段。上样后，质谱获取肽段质荷比（m/z）与碎片离子信息，通过UniProt数据库搜索匹配蛋白ID。

数据解析需控制假阳性率（FDR≤1%），报告蛋白覆盖度（≥10%可靠）、分子量、等电点。例如，鉴定肿瘤组织蛋白时，覆盖度15%、FDR=0.5%，结果可判定准确。

存储后定期复筛

长期存储样本每1-2年复筛，检测指标：完整性（SDS-PAGE条带是否降解）、浓度（与初始值误差≤10%）、活性（酶类Kcat值）。复筛样本量控制在aliquot的10%以内，避免影响后续使用。

复筛结果录入LIMS，更新样本状态：“良好”（指标无变化）、“需预警”（浓度下降10%-20%）、“不可用”（明显降解）。若降解，回溯存储过程（温度记录、aliquot次数），调整策略（如改为液氮存储）。

报告生成与追溯管理

报告需包含全流程信息：样本唯一标识、来源与采集信息、处理步骤（裂解液、分离方法）、检测结果（纯度、完整性、鉴定ID）、存储验证数据（稳定性曲线）、复筛记录（若有）。报告编号关联LIMS，确保可追溯。

数据需标准化：浓度用mg/mL，分子量用kDa，覆盖度用百分比。用户通过样本ID可查询每个步骤细节（操作人员、仪器型号、缓冲液配方），例如，查询血液样本分离过程，能看到“2023-05-10，离子交换pH7.2，流速1mL/min”的记录。