化工检测

医疗器械中聚合物材料因轻质、易加工等特性被广泛应用，但直接或间接接触人体时，可能释放有害物质影响细胞存活与功能。细胞毒性（cytotoxicity）测试作为医疗器械生物相容性评价的核心环节，通过模拟体内环境评估材料对细胞的潜在危害，是产品注册与上市的必备要求。本文将系统拆解其测试流程，助力理解聚合物材料的安全性验证逻辑。

测试前的样品制备与预处理

聚合物样品的制备需严格遵循测试标准（如ISO 10993-5）要求：首先确定样品尺寸与数量，通常需满足“材料表面积与浸提液体积比”（如3 cm²/mL或1 g/mL，根据材料形态调整），固体样品需切割为均匀小块以增加浸提接触面积，粉末或薄膜类样品需准确称量。

预处理环节的核心是去除样品表面的污染物与灭菌：常用环氧乙烷灭菌或γ射线灭菌，但需验证灭菌残留是否符合限度（如环氧乙烷残留＜10 μg/g）；若样品为水溶性或易降解材料，需避免预处理对其结构的破坏，可采用过滤除菌替代。

此外，样品需在浸提前进行“平衡处理”——将样品置于室温下的生理盐水中浸泡30分钟，去除表面附着的加工残留（如脱模剂），确保浸提液能真实反映材料的溶出物特性。预处理后的样品需尽快用于浸提，避免放置过久导致成分变化。

需注意，不同聚合物的预处理差异：如聚乳酸（PLA）等可降解材料，需避免高温或强溶剂处理，以防提前降解；而聚乙烯（PE）等惰性材料，可采用更严格的灭菌条件（如121℃高压蒸汽灭菌15分钟）。

细胞系的选择与培养

细胞系的选择需匹配医疗器械的临床应用场景：若材料用于皮肤创面（如敷料），优先选择人皮肤成纤维细胞（HSF）或小鼠成纤维细胞（L929）；若用于骨科植入物（如PLA骨螺钉），则选成骨细胞系（如MC3T3-E1）；血液接触类材料（如输液管）需选内皮细胞系（如HUVEC）。

ISO 10993-5推荐的“通用细胞系”为L929，因其实验重复性好、对毒性物质敏感，是入门级测试的首选。细胞培养需使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的DMEM或RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO₂、95%湿度的培养箱中。

细胞传代需控制在3-10代内，避免细胞老化导致的反应性下降；接种前需通过台盼蓝染色检测细胞活力，要求活细胞比例＞90%——活力不足的细胞会影响测试结果的准确性，需重新培养。

特殊细胞系（如原代细胞）需更严格的培养条件：比如HUVEC需添加内皮细胞生长因子（ECGF）与肝素，以维持其内皮细胞特性；成骨细胞需添加抗坏血酸与β-甘油磷酸钠，诱导其矿化能力，确保测试能反映材料对功能细胞的影响。

浸提液的制备

聚合物材料的细胞毒性测试通常采用“浸提液法”（而非直接接触法），因多数聚合物为固体，无法直接与细胞混合。浸提液的选择需覆盖材料的潜在溶出物特性：极性溶出物用生理盐水或含10%FBS的培养基；脂溶性溶出物用玉米油或聚山梨酯80溶液（需验证溶剂本身无毒性）。

浸提条件需严格遵循ISO 10993-5：常规测试采用“生理温度浸提”——37℃、24小时；若材料需加速溶出（如缓慢降解的PLA），可采用50℃、72小时，但需说明加速条件的合理性。浸提体积需满足“材料与浸提液的比例”：固体材料为3 cm²/mL（表面积/体积），粉末或颗粒为1 g/mL（质量/体积）。

浸提过程需保持“静态”（即不搅拌），模拟体内材料与体液的接触状态；若材料为多孔结构（如海绵敷料），需确保浸提液完全浸润样品，可通过真空脱气辅助。浸提结束后，浸提液需用0.22μm无菌滤膜过滤，去除可能的微生物与颗粒，避免干扰细胞测试。

需注意，浸提液需现用现配：若需保存，需置于-20℃冰箱，且保存时间不超过1周，避免溶出物降解或沉淀；复温时需缓慢解冻（4℃过夜），并轻轻混匀，确保成分均匀。

细胞接种与暴露处理

细胞接种需选择合适的孔板：96孔板（用于高通量检测，如MTT法）或24孔板（用于形态学观察）。96孔板的接种密度为1×10^4-2×10^4个细胞/孔，24孔板为5×10^4-1×10^5个细胞/孔——密度过低会导致细胞生长缓慢，过高则易出现接触抑制，均影响测试结果。

接种后需置于培养箱中孵育24小时，让细胞贴壁形成单层（悬浮细胞无需贴壁，但需调整接种密度）。贴壁完成后，吸去原培养基，加入不同浓度的浸提液：通常设置100%（纯浸提液）、50%（浸提液+等体积培养基）、25%（浸提液+3倍体积培养基）三个浓度，以评估剂量-反应关系。

暴露时间需匹配测试终点：若检测细胞活力（如MTT法），暴露24或48小时；若检测细胞增殖（如CCK-8法），暴露72小时；若检测凋亡（如Annexin V/PI染色），暴露12-24小时。暴露过程中需避免培养基蒸发，可在培养箱中放置水盘保持湿度，或使用带盖孔板。

特殊材料（如可降解聚合物）需延长暴露时间：比如PLA骨钉的浸提液，需暴露7天甚至14天，以评估降解产物的长期毒性；暴露期间需每天观察细胞状态，若出现大量死亡，需提前终止测试并记录。

细胞毒性的 endpoints 检测

细胞活力是最基础的毒性终点，常用方法为MTT法：原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将黄色MTT试剂还原为蓝紫色甲臜结晶，结晶量与活细胞数成正比。操作时，暴露结束后吸去浸提液，每孔加100μL含0.5 mg/mL MTT的培养基，孵育4小时后吸去上清，加100μL DMSO溶解结晶，用酶标仪在570 nm波长下测吸光度（OD值）。

CCK-8法是MTT的改良版，更敏感且无放射性：试剂中的WST-8能被活细胞脱氢酶还原为水溶性橙黄色产物，无需溶解步骤，直接测OD值（450 nm）。该方法适用于悬浮细胞与贴壁细胞，且对细胞毒性更小，适合长期测试。

细胞形态学观察是直观的毒性指标：通过光学显微镜观察细胞形态——正常贴壁细胞呈梭形或多边形，若出现细胞变圆、回缩、脱落（如L929细胞暴露于高浓度浸提液后），提示材料有细胞毒性；若需更细节的损伤（如线粒体肿胀、内质网扩张），需用透射电镜（TEM）观察：将细胞固定于2.5%戊二醛中，包埋、切片后染色，电镜下观察细胞器结构。

细胞凋亡是更精准的毒性终点，常用Annexin V/PI双染法：Annexin V能结合凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS），PI能穿透死细胞的破损膜染色DNA。操作时，收集暴露后的细胞，用Binding Buffer重悬，加Annexin V-FITC与PI染液，室温孵育15分钟，流式细胞仪检测：活细胞（Annexin V⁻/PI⁻）、早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻）、晚期凋亡/坏死（Annexin V⁺/PI⁺）。

阳性与阴性对照的设置

对照设置是确保测试有效性的关键，需包含三类对照：阴性对照、阳性对照与材料对照。阴性对照用于验证实验系统无自身毒性，通常为“不含浸提液的新鲜培养基”或“阴性对照材料的浸提液”（如ISO 10993-5推荐的高密度聚乙烯（HDPE），因HDPE化学惰性，无细胞毒性）。

阳性对照用于验证实验系统对毒性物质的敏感性，需选择已知细胞毒性的试剂：常用0.1% Triton X-100（表面活性剂，能破坏细胞膜）或10% DMSO（有机溶剂，能损伤细胞结构）。阳性对照的OD值（MTT法）需比阴性对照低50%以上，否则实验无效，需重新进行。

材料对照用于区分“材料本身”与“浸提液制备过程”的影响：比如若测试的是PLA薄膜，材料对照可为“未进行37℃浸提的PLA薄膜的培养基浸泡液”（即仅将薄膜放入培养基中1小时），以排除薄膜表面物理吸附对细胞的影响。

对照孔需与样品孔同步处理：比如接种相同密度的细胞、加入相同体积的溶液、相同的孵育时间。实验结束后，需计算“相对活力”（样品孔OD值/阴性对照OD值×100%），阳性对照的相对活力应＜50%，阴性对照的相对活力应＞90%，否则结果不可信。

结果判定与数据处理

结果判定需基于“相对活力”（Relative Viability, RV）：RV=（样品孔OD值/阴性对照孔OD值）×100%。根据ISO 10993-5，RV＞70%为“无细胞毒性”，50%-70%为“轻度毒性”，30%-50%为“中度毒性”，＜30%为“重度毒性”——重度毒性的材料需重新优化配方或工艺，轻度毒性需进一步评估临床风险。

数据处理需遵循统计学原则：每个浓度设置3-6个重复孔，计算平均值（Mean）与标准差（SD），以反映数据的离散程度；若重复孔的SD＞20%，需检查操作是否有误（如细胞接种不均匀、浸提液浓度不一致）。

统计分析用于验证差异的显著性：常用单因素方差分析（ANOVA）比较样品组与阴性对照组的OD值差异，若P＜0.05，说明样品的毒性与阴性对照有显著性差异；若做了剂量梯度，需进行线性回归分析，评估“剂量-反应关系”（如RV随浸提液浓度升高而降低，说明毒性有浓度依赖性）。

需注意，结果判定需结合多个终点：比如某PLA浸提液的RV为75%（无活力毒性），但BrdU掺入率比阴性对照低40%（增殖抑制），说明材料虽不影响细胞存活，但抑制细胞增殖，需进一步评估其对组织修复的影响（如骨科植入物需促进骨细胞增殖，否则可能导致愈合延迟）。