生物检测

微生物样本因成分复杂（含多糖、脂类、核酸等干扰物质）、蛋白质含量波动大（受培养条件、生长阶段影响），其蛋白质定量分析的准确性直接影响下游研究（如代谢组学、蛋白质组学）和临床诊断。第三方检测机构作为独立服务方，需建立严格技术规范，覆盖样本采集、处理、定量、质控全流程，确保结果可靠可比。

微生物样本采集与预处理的技术规范

细菌培养液需在对数生长期（OD600=0.6-0.8）采集，此时细菌代谢活跃、蛋白稳定；采集避免剧烈振荡，防止细胞破裂漏蛋白。离心收菌体转速8000-10000×g、5-10分钟、4℃，减少蛋白降解。

真菌菌丝体用无菌滤网过滤，预冷PBS冲2-3次去培养基；丝状真菌需剪碎（1-2mm）再破碎，避免菌丝缠绕。预处理立即加预冷蛋白酶抑制剂（PMSF 1mmol/L+EDTA 2mmol/L+抑肽酶1μg/mL），芽孢杆菌额外加苯甲脒1mmol/L增强抑制。

样本2小时内处理，否则-80℃冻存；解冻需4℃缓慢融化，反复冻融不超3次，防蛋白变性。

蛋白质提取方法的选择与验证要求

革兰氏阳性菌（如金葡菌）用溶菌酶（10-20mg/mL）37℃孵30分钟破细胞壁，再超声破碎（200-300W、工作3秒/间隔5秒、10次）放胞内蛋白。真菌（如酵母菌）用几丁质酶（5mg/mL）+蜗牛酶（10mg/mL）30℃孵1小时，机械匀浆（10000rpm、2分钟），提取液含1% Triton X-100增膜蛋白溶解度。

提取效率验证：同质量菌体用两法提取，总蛋白差<5%；SDS-PAGE看条带，无明显低分子量降解带为合格。蛋白纯度测A260/A280，1.8-2.0为佳；>2.0加核酸酶去核酸，<1.8用苯酚-氯仿抽提去多糖/脂类。

蛋白质定量方法的适用性评估规范

BCA法适多数样本，但避还原剂（如DTT）——含DTT需用3kDa透析袋 PBS透析2小时。Bradford法对碱性蛋白（如组蛋白）敏感低，放线菌等富含碱性蛋白需换Lowry法；去污剂（如SDS）浓度<0.1%，防染料沉淀。

荧光法（如Qubit）敏度高（低限1μg/mL），适环境微生物低浓度样本，但需做荧光淬灭试验避次生代谢物干扰。适用性评估做线性范围（覆盖样本浓度）与干扰试验（回收率90%-110%），不达标则调整处理方法。

标准品与质控体系的建立要求

标准品选≥98%纯度，优先匹配样本来源（如乳酸菌蛋白用乳酸菌标准品）；BSA通用但需做基质匹配，防酸性蛋白等基质效应。质控品分低（20μg/mL）、中（100μg/mL）、高（500μg/mL）浓度，每批同样本处理，结果需在靶值±10%内。

室内质控每日做，绘Levey-Jennings图监控稳定；超3σ范围需停机查标准品/仪器。第三方需参室间质评（如CNAS能力验证），不合格则分析原因（方法/操作）并纠正。

数据处理与结果报告的技术要求

数据先扣空白（用处理缓冲液），3个平行样取平均，RSD<10%；超10%需重测（样本不均/移液器误差）。标准曲线做5点（20-500μg/mL），R²≥0.99，不用单点校准防线性偏差。

报告需含：样本处理（溶菌酶破碎、透析去还原剂）、定量方法（BCA）、标准品（BSA 99%）、干扰结果（回收率95%）、质控（中浓度105μg/mL，靶值100μg/mL）。注明不确定度（标准品1%+重复5%+方法3%，合成≈5.9%），结果写“X±5.9%μg/mL”。

交叉污染的防控技术规范

提取区（处理菌体）与定量区（测吸光度）物理隔离，避气溶胶污染；致病性微生物用BSL-2生物安全柜，操作后75%乙醇擦台面、UV照30分钟。器械一次性（枪头/离心管/探头），重复器械用1%次氯酸钠泡30分钟再冲净。

每批做阴性对照（无微生物培养基同处理），若浓度>5μg/mL说明污染，需重处理样本并查流程（器械灭菌/台面清洁）。样本用唯一条形码标记，按顺序处理避混淆。

人员资质与实验室环境的要求

人员需持微生物检验证，熟悉培养、处理、定量方法；每年2次培训（新规范/仪器操作），考核（理论+操作）合格上岗。实验室温20-25℃（防蛋白降解）、湿40-60%（防仪器潮）；致病性实验室符GB 19489-2008，有高压灭菌器/生物安全柜/洗眼器。

仪器定期校准：移液器每6个月校（体积误差<1%），分光光度计每3个月校波长（误差<1nm），酶标仪校吸光度（误差<0.01A）。每台仪器建维护记录，记校准/故障/维修内容（如分光光度计2024-03-15校562nm、误差0.5nm、张三操作）。