生物检测

微量样本蛋白质修饰分析是临床分子诊断、肿瘤精准医学及干细胞研究的核心技术，需解析磷酸化、乙酰化等翻译后修饰的变化。但微量样本（<1mg组织、<10μL体液或<1×10^5个细胞）蛋白质含量低、修饰易降解，样本制备成为第三方检测的关键瓶颈。本文围绕微量样本特性，系统梳理蛋白质修饰分析中样本制备的技术要点，为第三方检测的标准化实施提供参考。

微量样本的定义与收集前提

微量样本的界定基于检测灵敏度：细胞样本<1×10^5个、组织样本<1mg、体液样本<10μL，蛋白质总量通常<10μg。这类样本需严格控制收集变量，核心是“鲜、净、准”——采集后30分钟内冰上或液氮速冻，避免修饰降解；无菌操作去除血液、脂肪等杂质，用无酶管收集；清晰标记患者ID、采集时间等信息，确保追溯准确。

特殊样本需特定富集：如循环肿瘤细胞用免疫磁珠分选，干细胞球用温和离心富集，富集后立即裂解，避免培养改变修饰状态。

裂解液的组分设计与适配性

裂解液需平衡“破膜效率”与“修饰保留”。表面活性剂选择：SDS（1%）提取效率高，适合磷酸化等强稳定修饰；NP-40（0.5%）更温和，适配乙酰化、泛素化等弱相互作用修饰。蛋白酶/磷酸酶抑制剂需精准：通用cocktail抑制丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶；磷酸化修饰加Na3VO4（1mM）和NaF（10mM）抑制磷酸酶；亚硝基化修饰用NEM（10mM）封闭自由巯基，避免还原剂破坏。

pH值稳定是关键：用Tris-HCl（pH7.4-8.0）缓冲，酸性组织（如胃黏膜）调至pH8.5，避免蛋白变性或修饰脱落。

蛋白质提取的效率强化策略

微量样本提取需“温和高效”：超声破碎（功率20%-30%、工作30s/间隔60s、重复3次）破膜且避免过热；玻璃匀浆器（200μL）适合少量组织，手动研磨减少损失。反复冻融控制2次（-80℃冻10分钟、37℃融），避免蛋白降解。

辅助试剂提升提取率：核酸酶（DNase I/RNase A，1μg/μL）降解DNA/RNA降低黏度；EDTA（1mM）螯合金属离子抑制金属蛋白酶。离心条件优化：12000g、4℃离心15分钟，细胞样本缩短至10分钟，组织样本延长至20分钟，去除碎片且避免蛋白沉淀。

修饰特异性富集的关键参数控制

修饰富集需匹配亲和材料：磷酸化用TiO2或IMAC树脂，乙酰化用抗乙酰化抗体，泛素化用His-ubiquitin树脂。富集前用Micro BCA定量（0.5-20μg/mL），避免树脂过载——10μg蛋白对应10μL TiO2树脂。

孵育与洗涤严格控制：4℃旋转混合1-2小时，洗涤用含150mM NaCl和20%乙腈的缓冲液，洗3-5次去除非特异性结合。洗脱需温和：TiO2用5%氨水，乙酰化抗体用0.1M glycine-HCl（pH2.5），洗脱后立即中和，避免修饰破坏。

除杂与浓缩的温和性操作

微量样本除杂浓缩需避免损失：超滤管（截留3kDa或10kDa）4℃、12000g离心15分钟，浓缩至10μL以下，同时去除盐和小分子；TCA-丙酮沉淀（10% TCA-丙酮溶液-20℃放置1小时）适合<5μg蛋白，用冷丙酮洗3次去残留；甲醇-氯仿沉淀（体积比4:1:3）回收率更高，沉淀后甲醇洗涤干燥。

需避免透析（死体积大）和长时间真空干燥（蛋白变性）。

样本稳定性的全程把控

样本稳定性需全程控制：裂解前-80℃保存，最多冻融2次；裂解后立即富集或定量，短期（<24小时）4℃保存，长期加50%甘油-80℃保存。巯基修饰加BHT（1mM）抗氧化，光敏感修饰用铝箔包裹容器。

运输用干冰（-78℃），时间不超48小时，箱内放温度监控仪，确保全程低温。

第三方检测的标准化与溯源性要求

第三方检测需建立SOP：固定超声功率、裂解液配方（1% SDS+1×蛋白酶抑制剂+1mM Na3VO4）、富集树脂用量等参数，避免个体差异。试剂用有证标准品（如Sigma-Aldrich的cocktail），记录批号；耗材用无酶无蛋白污染产品（如Corning离心管）。

每批样本加质控品（如磷酸化ERK1/2，1μg/μL），监控回收率>70%；记录处理时间、操作人员、试剂批号等信息，形成溯源链。

常见修饰类型的针对性调整

磷酸化修饰：裂解液加Na3VO4和NaF，用TiO2树脂富集，5%氨水洗脱；乙酰化修饰：裂解液Tris<50mM，用抗乙酰化抗体富集，500mM NaCl洗涤；泛素化修饰：裂解液加NEM抑制去泛素化酶，用His-ubiquitin树脂富集，250mM咪唑洗脱；亚硝基化修饰：不用还原剂，用生物素switch法富集，DTT洗脱。