生物检测

植物病原菌（如真菌、细菌、病毒）是作物病害的主要诱因，其分泌或表达的蛋白质（如效应蛋白、致病酶类）是解析致病机制的核心靶点。体外培养检测服务通过模拟病原菌在植物体内的生长环境，实现目标蛋白的分离纯化与结构功能鉴定，为植物病理学研究、抗病育种及病害防控提供关键技术支撑，是连接基础研究与应用实践的重要纽带。

体外培养体系构建：还原病原菌的“体内生长状态”

体外培养的核心是模拟病原菌在植物体内的营养条件与微环境，确保分泌或表达的蛋白质贴近真实致病场景。以真菌病原菌（如稻瘟病菌）为例，需选择oatmeal agar或Richards培养基，调整碳氮源比例（如葡萄糖与硝酸钾比值为5:1）以模拟植物细胞营养组成；细菌病原菌（如青枯菌）采用液体NB培养基，控制摇床转速（180 rpm）与温度（28℃），模拟植物维管束的氧气浓度与温度。

培养时间需基于生长曲线确定：对数生长期病原菌代谢活跃，分泌蛋白量最多，因此通过OD600值监测生长状态（如青枯菌培养12-24小时）。

此外，病原菌形态差异需考量：研究稻瘟病菌附着胞相关蛋白时，选择孢子萌发后的培养体系；研究菌丝扩展相关蛋白，则以菌丝体培养物为材料。

蛋白质分离：从复杂混合物到高纯度样品的“阶梯式提纯”

病原菌培养物中的蛋白包括胞内蛋白、分泌蛋白及培养基杂蛋白，需多步分离提纯。第一步样品预处理：细菌培养物离心收集上清（分泌蛋白），真菌过滤收集菌丝体（胞内蛋白）或培养液上清（分泌蛋白）；病毒样品从感染植物组织提取病毒颗粒，再裂解获取病毒蛋白。

粗分离常用盐析法（如硫酸铵分步沉淀），利用蛋白溶解度差异富集目标蛋白：例如青枯菌分泌蛋白通过50%饱和度硫酸铵沉淀去除小分子杂质；或用10 kDa超滤离心管浓缩样品提高蛋白浓度。精细分离采用层析技术：离子交换层析（如DEAE-纤维素柱）按电荷分离碱性蛋白，凝胶过滤层析（如Sephadex G-75）按分子量纯化胞内酶类，亲和层析（如Ni-NTA柱）一步纯化带His标签的重组蛋白。

凝胶电泳（SDS-PAGE）是常用分离手段，通过分子量差异将蛋白分离为条带，适合后续质谱鉴定。例如分离稻瘟病菌分泌蛋白时，先进行SDS-PAGE，切取目标条带酶解后再质谱分析。

蛋白质鉴定：从肽段信息到功能注释的“全链条解析”

分离后的蛋白需通过质谱技术解析身份与功能。第一步酶解：用胰蛋白酶将蛋白切成3-20个氨基酸短肽，提高质谱检测灵敏度。常用质谱技术包括MALDI-TOF MS（适合单一蛋白，如纯化的效应蛋白）与LC-MS/MS（适合复杂蛋白混合物，如病原菌胞内蛋白组）。

质谱数据与基因组数据库匹配：将肽段质量指纹或序列信息与NCBI、Ensembl Fungi等数据库比对，确定蛋白基因来源（如稻瘟病菌Mgv1蛋白对应基因MGG_02631）。生物信息学注释进一步解析功能：GO分析明确分子功能（如Mgv1的丝氨酸/苏氨酸激酶活性）、细胞组分（定位于细胞质）及生物过程（参与有丝分裂）；KEGG分析揭示参与的通路（如MAPK信号通路），推测其在病原菌生长中的作用。

质控体系：保障结果可靠性的“三道防线”

服务核心是结果可信，需三重质控确保准确性。首先是重复性验证：同一病原菌样品3次独立实验，要求蛋白电泳图谱条带位置与强度一致（CV值≤10%），鉴定结果重叠率≥90%。

其次是回收率检测：样品中加入已知浓度标准蛋白（如BSA），计算分离回收率（要求≥80%）。若回收率低，调整分离条件（如改变硫酸铵饱和度、优化层析柱洗脱流速）。

最后是准确性评估：用已知蛋白（如溶菌酶、BSA）盲测，验证质谱鉴定正确率（要求≥95%）。同时控制交叉污染：不同病原菌样品的培养容器、试剂独立使用，避免杂菌或杂蛋白干扰。

定制化调整：针对不同病原菌的“差异化处理策略”

真菌、细菌、病毒生物学特性差异大，服务需定制化优化。真菌（如小麦赤霉病菌）为丝状真菌，用液氮研磨破碎菌丝体提取胞内蛋白，分泌蛋白用0.22μm滤膜过滤培养液去除菌丝碎片；细菌（如丁香假单胞菌）是单细胞，分泌蛋白在上清，胞内蛋白需超声破碎（200 W，工作3s停5s，共10次）提取；病毒（如黄瓜花叶病毒CMV）无细胞结构，从感染叶片提取病毒颗粒（PEG沉淀、超速离心纯化），再用SDS裂解液提取衣壳蛋白。

针对难培养病原菌（如植原体），采用昆虫介体（如叶蝉）体外培养，收集介体细胞提取蛋白；专性寄生菌（如白粉菌）用寄主植物叶片离体培养，刮取菌丝体提取蛋白。

服务结果应用：从实验室到田间的“技术转化”

服务结果应用覆盖多场景：致病机制研究中，鉴定的效应蛋白通过基因敲除验证功能（如稻瘟病菌AvrPita效应蛋白，敲除后丧失对含Pita基因水稻的致病性）；抗病靶标筛选中，致病酶类（如青枯菌纤维素酶）作为靶标，开发小分子抑制剂（如木聚糖酶抑制剂）阻断细胞壁降解；诊断试剂开发中，特异性蛋白（如番茄晚疫病菌Pinf蛋白）作为抗原，制备单克隆抗体开发ELISA试剂盒用于田间快速检测。

此外，结果支撑抗病育种：鉴定的病原菌毒性蛋白用于筛选抗病种质（如用稻瘟病菌Avr1-CO39蛋白筛选含Pi-CO39基因的水稻品种），加速抗病品种培育。