生物检测

蛋白质修饰是调控蛋白功能、参与疾病发生的关键机制，如磷酸化、乙酰化等修饰异常与肿瘤、神经疾病密切相关。第三方检测机构需为客户提供高效、准确的修饰分析服务，而Western blot（WB）与质谱（MS）是两类核心技术，但二者在原理、性能及适用场景上差异显著。本文围绕第三方检测的实际需求，对比二者在蛋白质修饰分析中的应用特点，为技术选择提供参考。

技术原理与修饰类型覆盖差异

Western blot的核心原理是抗原-抗体特异性结合：首先通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜后用修饰特异性抗体（如一抗针对磷酸化丝氨酸）识别目标蛋白，再经二抗孵育与化学发光显影呈现结果。这种技术高度依赖抗体的特异性，仅能检测有商业化抗体的修饰类型，如常见的磷酸化（Ser/Thr/Tyr）、乙酰化（Lys）等。若客户需检测稀有修饰（如巴豆酰化、琥珀酰化）或未知修饰，因缺乏对应抗体，WB无法完成分析。

质谱技术则通过质量差异识别修饰：蛋白先经胰蛋白酶酶解为肽段，通过液相色谱分离后离子化，质谱仪检测肽段的质荷比（m/z），结合串联质谱（MS/MS）碎裂肽段分析序列。修饰会导致肽段质量变化（如磷酸化+80Da、乙酰化+42Da），质谱可通过比对理论与实际质量差，直接识别修饰位点——无论该修饰是否有抗体。因此，MS能覆盖更广泛的修饰类型，包括未知修饰，适合探索性研究。

灵敏度与检测限的性能差距

WB的灵敏度受抗体亲和力与显影系统限制：化学发光法是WB常用的高灵敏显影方式，检测限约为1-10ng蛋白；若修饰蛋白丰度极低（如低表达激酶的磷酸化形式），或样本中修饰蛋白占比<0.1%，WB可能无法检测到清晰条带。例如，临床血清中低丰度的磷酸化蛋白（如p-EGFR），因浓度低于WB检测限，常需先富集才能检测。

质谱的灵敏度远高于WB：纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）可检测fmol级（10^-15 mol）的修饰肽段，高分辨质谱（如Orbitrap）甚至可达amol级（10^-18 mol）。这源于纳米柱的高分离效率（减少肽段竞争）与离子化效率提升，加上MS/MS的序列确证能力，即使样本中修饰肽段占比极低（如<0.01%），经TiO2或Fe3O4富集后，也能准确检测。例如，细胞裂解液中低丰度的磷酸化肽段，可通过MS富集后实现高灵敏度分析。

定量能力与准确性的本质区别

WB是典型的半定量技术：通过凝胶成像系统分析条带灰度值，线性范围窄（通常仅1-10倍差异），易受实验变量影响——抗体浓度、孵育时间、显影温度的微小变化，都可能导致灰度值波动。第三方检测中，同一批样本重复WB实验，灰度值的变异系数常超过20%，难以满足精准定量需求。

质谱可实现精准定量：相对定量中，iTRAQ或TMT标记技术通过不同同位素标签区分多个样本（最多16个），同时定量修饰位点的表达差异；绝对定量则用SRM/MRM技术，通过同位素标记的内标肽段校准，误差可控制在10%以内。例如，临床肿瘤样本的磷酸化位点定量，MS能准确区分健康组与患者组的2倍差异，而WB可能因误差遗漏这一变化。

样品需求量与处理复杂度对比

WB对样品量要求较高：通常需20-100μg蛋白，因电泳、转膜过程中蛋白损失大，且需足够量才能形成可见条带。若客户提供的样本珍贵（如临床穿刺样本仅能提取10μg蛋白），WB可能无法满足检测需求，导致样本浪费。

质谱的样品消耗量显著更低：仅需1-10μg蛋白即可完成分析。蛋白酶解为肽段后，通过液相色谱富集低丰度修饰肽段（如磷酸化肽段用TiO2富集），进一步减少样本消耗。例如，5μg肿瘤穿刺样本的蛋白提取物，可通过MS检测到上百个磷酸化位点，完全覆盖客户的检测需求。

此外，质谱的样品处理更强调“肽段水平”的富集，而非WB的“蛋白水平”分离，步骤更适配微量样本。

通量与检测效率的实际差异

WB的通量较低：一次电泳可处理10-20个样本，每个样本仅能检测1-2个修饰位点，总耗时约2-3天（电泳转膜1天、抗体孵育1天、显影1天）。若客户需检测多个修饰位点（如同时检测磷酸化与乙酰化），需多次重复实验，效率极低。

质谱的通量优势明显：一次nanoLC-MS/MS运行（约1-2小时）可检测1个样本的数百个修饰位点，结合自动进样系统，一天可处理20-30个样本。例如，大规模临床样本的磷酸化组分析，MS可在一周内完成数百个样本的检测，而WB需数月才能完成，显著提升第三方检测的效率。

成本与可及性的现实考量

WB的初期成本较低：设备（电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统）合计约5-10万元，适合中小型第三方机构开展。但修饰特异性抗体的成本较高（每支约3000-8000元），且部分抗体存在交叉反应（如识别非目标修饰位点），需额外验证成本，长期来看单位样本成本并不低。

质谱的初期投入高：高分辨质谱（如Orbitrap）约200-500万元，维护成本每年约10-20万元，且需专业操作人员（质谱工程师、生物信息分析师）。但质谱的单位样本成本低——若通量充足，每个样本约500-1000元，适合大规模检测。不过，质谱的可及性较低，仅大型第三方机构具备开展条件。