食品检测

蒽酮比色法是碳水化合物定量检测的经典技术，基于糖类与蒽酮-浓硫酸反应生成蓝绿色复合物的原理，适用于单糖、双糖、多糖等多种碳水化合物的测定，因操作简便、灵敏度高（检测限低至1μg/mL），广泛应用于食品、农业、生物医药等领域。本文将从准备工作、试剂配制、曲线绘制到样品测定，系统拆解其标准化操作步骤，助力实验人员规避误差、获得可靠结果。

实验前的准备工作

仪器清单及调试：需准备分光光度计（提前20分钟预热，波长校准至620nm）、恒温水浴锅（预热至100℃，温度误差≤0.5℃）、台式离心机（转速校准至4000rpm，离心管需平衡）、10/50/100mL容量瓶（校准体积，误差≤0.1mL）、1/5/10mL移液管（用前用待移液体润洗3次）。

样品的预处理前准备：固体样品（如谷物、干果）需粉碎至过40目筛，保证颗粒均匀；液体样品（如果汁、牛奶）需提前离心去除悬浮物；生物组织（如植物叶片、动物肝脏）需液氮冷冻保存，防止糖降解。

玻璃器皿的清洗：所有接触样品和试剂的器皿需用10%盐酸浸泡2小时，去除残留糖或有机物，再用蒸馏水冲洗3次，晾干备用；容量瓶、移液管避免用碱性洗涤剂，防止玻璃腐蚀影响体积准确性。

环境注意事项：实验台需清洁，避免灰尘或空气中的糖污染；试剂瓶贴清晰标签（如“蒽酮试剂”“葡萄糖标准液”）；操作时戴手套，防止手汗中的糖污染样品。

关键试剂的配制方法

蒽酮试剂配制：称取0.1g蒽酮（分析纯），用10mL无水乙醇溶解（避免水解），缓慢倒入90mL冷却至室温的浓硫酸中（浓硫酸需提前放置2小时至25℃），边倒边快速搅拌，防止局部过热分解；试剂呈淡黄色，若变深则失效。

蒽酮试剂保存：立即转入棕色磨口瓶，密封后4℃冷藏，保存不超过24小时；使用前恢复至室温，避免温度差导致加样时溅出。

标准葡萄糖储备液：准确称取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖0.1000g（分析天平，精确到0.0001g），加少量蒸馏水溶解，转入100mL容量瓶，定容至刻度，得到1mg/mL储备液（4℃保存1周）。

标准工作液稀释：取储备液10mL，定容至100mL得0.1mg/mL工作液；再吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL工作液，分别定容至10mL，得到0.00-0.10mg/mL的标准系列溶液（空白为0.00mg/mL）。

标准曲线的绘制步骤

加样与反应：取6支干燥比色管，依次加入1.0mL标准系列溶液（从低到高浓度），每管缓慢加入5.0mL蒽酮试剂（沿管壁流下，减少气泡），轻轻摇匀。

水浴控制：放入100℃沸水浴加热10分钟（秒表计时），确保比色管直立、液面低于水浴水面，避免温度不均。

冷却稳定：水浴后立即转入冰水浴冷却5分钟（或室温冷却至25℃以下），终止反应；冷却后不要摇动，防止溶液浑浊。

吸光度测定：分光光度计预热20分钟，波长调至620nm；用空白液调零，将标准液倒入1cm比色皿（擦净外壁），每个浓度测3次取平均值。

曲线绘制：以浓度（mg/mL）为横坐标、平均吸光度为纵坐标，Excel拟合线性方程（如A=10.5C+0.003），要求R²≥0.995，保证线性关系。

样品的前处理方法

固体样品提取：称1.00g粉碎样品（如小麦粉），加20mL蒸馏水，沸水浴加热30分钟（每10分钟振荡1次）；冷却后4000rpm离心10分钟，上清液转入50mL容量瓶。

固体样品定容：用蒸馏水冲洗离心管2次，洗液并入容量瓶定容；根据含糖量稀释（如高糖样品稀释10倍，低糖样品稀释2倍），确保浓度在0.02-0.10mg/mL范围内。

液体样品处理：取5mL液体（如果汁），4000rpm离心10分钟去沉淀；取1mL上清液定容至10mL得稀释液，高糖样品可再稀释5-10倍。

生物组织处理：取0.5g新鲜组织（如水稻叶片），液氮研磨成粉；加5mL预冷80%乙醇（抑制酶活性），80℃水浴10分钟，离心取上清；重复提取2次，合并上清液定容至25mL。

显色反应的条件控制

水浴温度：必须保持100℃，温度过低（如95℃）会导致显色不完全，吸光度偏低；过高（如105℃）会使糖分解，颜色加深。

水浴时间：严格控制10分钟，时间不足显色不够，过长（如15分钟）会使蓝绿色消退（尤其多糖）；所有样品反应时间需一致。

冷却方式：冰水浴冷却更高效，能快速终止反应；室温冷却需确保环境温度20-25℃，避免吸光度波动。

加样顺序：蒽酮试剂需缓慢加入样品液，而非相反；浓硫酸遇水放热，反向操作易导致液体飞溅，损失样品。

样品的比色测定操作

样品液移取：用移液管准确吸取1.0mL处理后样品液（记录稀释倍数），置于比色管；移液管需用样品液润洗3次，避免稀释误差。

显色反应：按标准曲线步骤加5.0mL蒽酮试剂，沸水浴10分钟，冰水浴冷却5分钟；操作顺序与标准曲线一致，确保条件相同。

吸光度测定：空白液调零后，测定样品吸光度；每个样品测3次取平均，若吸光度超曲线最大值（如0.8），需稀释后重测。

异常值处理：平行样吸光度差异超5%（如0.42、0.46、0.51），需检查移液准确性、反应时间或比色皿清洁度，重新测定。

结果计算的关键要点

浓度计算：将样品平均吸光度代入标准曲线方程，如方程A=10.2C+0.005，样品A=0.38，则C=(0.38-0.005)/10.2≈0.0367mg/mL。

含量计算：用公式“含量（mg/g）=（C×V×n）/m”计算，其中V是定容体积（mL）、n是稀释倍数、m是样品质量（g）；如C=0.03mg/mL、V=50mL、n=10、m=1.0g，含量=（0.03×50×10）/1.0=15mg/g。

单位与有效数字：固体样品单位mg/g（或g/100g），液体样品mg/mL（或g/100mL）；结果保留三位有效数字（如15.2mg/g、8.56mg/mL）。

空白扣除：若空白吸光度不为0（如0.01），需从样品吸光度中减去；如样品A=0.35、空白A=0.01，校正后A=0.34，再计算浓度。