生物检测

串联质谱（MS/MS）是蛋白质修饰分析的核心技术，在第三方检测中因高灵敏度和特异性广泛应用。蛋白质修饰（如磷酸化、乙酰化）丰度低、异质性高，需精准鉴定。本文从样品处理到数据解析，详解其原理，揭示技术逻辑。

修饰分析的样品前处理要点

第三方检测中，蛋白质修饰分析的第一步、样品前处理。

样本需用含尿素的裂解液破坏蛋白结构，释放修饰基团，同时加蛋白酶抑制剂防降解。

接下来，用DTT还原二硫键，再用IAA封闭游离巯基，避免肽段重新形成二硫键。

然后用胰蛋白酶酶解蛋白为10-20 AA的肽段——这是质谱最适长度。

酶解条件要严：酶比1:50-1:100，37℃孵育12-16小时，避免短肽或长肽。

关键是保留修饰真实性：磷酸化忌酸性，酶解用中性碳酸氢铵；乙酰化忌高温，孵育37℃。

第三方通过SOP确保重复性，减少批次差异。

修饰肽段的富集策略

修饰肽段丰度低，如磷酸化仅0.1%-1%，需靶向富集。

磷酸化用TiO2（MOAC）：酸性条件结合磷酸基团，碱性洗脱。

或用抗磷酸化抗体（IAC）：特异性捕获磷酸丝/苏/酪氨酸肽段。

乙酰化用抗乙酰化赖氨酸抗体，泛素化用抗GG标签抗体（泛素水解留GG）。

富集后需脱盐（C18 ZipTip），去除盐离子、洗涤剂等杂质。

第三方依修饰类型选方法，如磷酸化用TiO2，乙酰化用抗体。

串联质谱的离子分离机制

串联质谱由MS1、碰撞池、MS2组成。

修饰肽段先经反相C18柱分离：疏水性梯度洗脱，按疏水性强弱出峰。

进入MS1后，电喷雾离子化（ESI）为气态离子，测m/z和强度。

DDA模式选Top10强离子，用窄隔离窗口（0.7-1.2 m/z）选目标离子。

窄窗口提高特异性，避免修饰肽段受相邻离子干扰。

目标离子进碰撞池，与氮气碰撞产碎片，再进MS2测碎片m/z。

修饰肽段的碎裂模式

串联质谱的核心是离子碎裂，产特征碎片推断序列和修饰。

碰撞诱导解离（CID）：断裂酰胺键，产b/y离子，但磷酸化易丢80 Da。

高能碰撞解离（HCD）：高能碎裂，保留修饰，适合磷酸化。

电子转移解离（ETD）：电子转移碎裂，保不稳定修饰（如泛素化GG）。

第三方依修饰类型选模式：磷酸化用HCD，泛素化用ETD。

碎裂模式选对了，才能保留修饰信息，准确鉴定。

修饰位点的匹配原理

修饰位点鉴定靠MS2谱与理论谱匹配。

工具（如MaxQuant）依MS1的m/z搜数据库，找可能的肽段。

然后模拟碎裂生理论谱，与实验MS2谱比对，算匹配得分。

修饰位点需特异碎片支持：如磷酸化Ser的y离子多80 Da，说明Ser是位点。

第三方要求位点概率≥75%（Localization Probability≥0.75）。

比如肽段Ala-Ser-PO3H2-Lys，y2离子多80 Da，确认识点。

特异性碎片离子的识别

不同修饰有特征碎片离子，是鉴定关键。

磷酸化产m/z79（PO3⁻）、97（H2PO4⁻）——这是磷酸化的标志。

乙酰化产m/z43（CH3CO⁺），泛素化产m/z114（GG碎片）。

无特征碎片，即使序列匹配也不算修饰。

质量偏移也助判断：磷酸化+80 Da，乙酰化+42 Da。

第三方双重验证（特征碎片+质量偏移），避免误判。

第三方检测的数据质控

第三方检测需严格质控，确保结果可靠。

前处理质控：电泳验蛋白完整性，肽浓度测确保上样一致。

色谱质控：用标准肽段验分离效果，CV<5%才合格。

质谱质控：定期校准，m/z误差<5 ppm。

数据采集质控：重复进样，CV<20%。

解析质控：反向库控FDR<1%，位点概率≥75%。

质控报告含电泳图、校准报告、FDR值等，保障信任。

质谱与生物信息学的协同

串联质谱产海量数据，需生物信息学工具解析。

MaxQuant自动化处理：峰识别、肽匹配、位点鉴定、定量。

PhosphoRS算法统计碎片强度，算位点概率——如Ser/Thr都可能，依b/y离子强度判真位点。

工具的定量功能（Label-free或TMT）助看修饰水平变化。

第三方用MaxQuant+PhosphoRS，高效准确解析。

协同作用是修饰分析的关键，缺一不可。