食品检测

膳食纤维是人体必需的第七大营养素，其含量与组成是食品营养评价的核心指标之一。高效液相色谱法（HPLC）凭借分离效率高、灵敏度好、结果重复性佳等特点，成为膳食纤维检测的主流技术。本文围绕HPLC法检测膳食纤维的全流程，详细拆解试剂准备、样品处理、酶解、水解及色谱分析等关键步骤，为实验室规范化操作提供实操指南。

试剂与材料准备

试剂需提前配置并验证有效性：1、缓冲液：pH6.0磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，由Na₂HPO₄与KH₂PO₄按比例混合）、pH7.5 Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L，用Tris碱加HCl调节pH）；2、酶制剂：α-淀粉酶（活力≥1000U/mg，用于分解淀粉）、蛋白酶（活力≥500U/mg，用于分解蛋白质）、葡萄糖苷酶（活力≥100U/mg，用于分解剩余可消化碳水化合物）；3、沉淀剂：预冷95%乙醇（分析纯，用于沉淀膳食纤维）、无水乙醇（分析纯，用于洗涤）；4、水解试剂：1.0mol/L硫酸溶液（用于将膳食纤维水解为单糖）、30%氢氧化钠溶液（用于中和酸）；5、标准品：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖标准品（纯度≥99%，用于绘制标准曲线）；6、流动相：乙腈-水混合液（体积比75:25，经0.45μm有机相滤膜过滤并超声脱气15分钟）。

材料需提前调试到位：高效液相色谱仪（配备示差折光检测器RID或蒸发光散射检测器ELSD）、恒温水浴锅（精度±1℃）、高速离心机（转速≥5000rpm）、真空干燥箱（45℃恒温）、0.45μm有机相微孔滤膜、分析天平（精度0.0001g）、250mL具塞三角瓶、10mL移液管。

样品前处理

固体样品（如谷物、豆类、果蔬）：先在45℃真空干燥至恒重，用高速粉碎机粉碎后过40目标准筛，筛下物装入干燥器密封备用；液体样品（如果汁、酸奶）：在40℃下减压浓缩至原体积的1/5，去除游离水分以减少干扰。

称样：精确称取1.0000-2.0000g处理后的固体样品（或浓缩后的全部液体样品），置于250mL具塞三角瓶中，加入50mL pH6.0磷酸盐缓冲液，用漩涡振荡器振荡1分钟，使样品完全分散，避免结块影响后续酶解。

酶解去除淀粉与蛋白质

淀粉水解：向样品液中加入10mgα-淀粉酶（精确至0.1mg），摇匀后放入95-100℃恒温水浴锅，保温30分钟，期间每5分钟摇晃一次，确保酶与样品充分接触；水浴结束后立即放入冰水浴，冷却至室温以终止酶反应。

蛋白质水解：用1mol/L氢氧化钠溶液调节样品液pH至7.5，加入10mg蛋白酶，摇匀后置于60℃恒温水浴锅，保温30分钟，每10分钟摇晃一次；冷却后用1mol/L盐酸调节pH至4.5，加入10mg葡萄糖苷酶，再次放入60℃水浴锅保温30分钟，分解剩余的可消化碳水化合物；最后将三角瓶放入沸水浴10分钟，使酶彻底失活，冷却至室温。

膳食纤维的沉淀与收集

向酶解后的样品液中加入4倍体积的预冷95%乙醇（即200mL），摇匀后放入4℃冰箱静置1小时，使膳食纤维充分沉淀；将样品液转移至离心管，以5000rpm的转速离心15分钟，弃去上清液（上清液中含小分子糖等可溶物），收集管底的沉淀，即为总膳食纤维（TDF）。

洗涤沉淀：用78%乙醇（50mL）洗涤沉淀2次（每次摇匀后离心10分钟，弃上清），去除残留的小分子糖；再用无水乙醇（50mL）洗涤1次，去除水分；最后用丙酮（50mL）洗涤1次，去除脂类杂质。将洗涤后的沉淀转移至预先称重的坩埚中，放入45℃真空干燥箱干燥至恒重，记录沉淀的质量（记为m₁）。

膳食纤维的酸水解

将干燥后的膳食纤维沉淀倒入250mL具塞三角瓶，加入50mL 1.0mol/L硫酸溶液，摇匀后放入100℃恒温水浴锅，保温2小时，期间每15分钟摇晃一次，确保膳食纤维完全水解为单糖（如葡萄糖、木糖等）；水解结束后冷却至室温，用30%氢氧化钠溶液调节pH至中性（用pH试纸或pH计验证）；将溶液转移至100mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀备用。

水解液的净化

取10mL定容后的水解液，转移至离心管中，以8000rpm的转速离心10分钟，去除不溶性杂质；取离心后的上清液，通过0.45μm有机相微孔滤膜过滤（滤膜使用前需用去离子水冲洗3次，去除残留杂质），收集滤液作为待测样品溶液，避免杂质堵塞色谱柱或干扰检测结果。

色谱条件设置

色谱柱选择：优先选用碳水化合物专用柱（如Waters Sugar-Pak 1柱，300mm×6.5mm，10μm）或氨基柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温设置为30℃；流动相为乙腈-水混合液（体积比75:25），流速为1.0mL/min；检测器参数：若使用示差折光检测器（RID），则检测器温度设置为35℃，灵敏度调至16；若使用蒸发光散射检测器（ELSD），则漂移管温度为45℃，载气（氮气）流速为2.0L/min；进样量固定为20μL。

标准曲线绘制

制备单糖标准储备液：分别准确称取葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖标准品各0.1000g，置于100mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀后得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液；制备标准工作液：分别吸取标准储备液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、8.0mL，置于10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得到浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的标准工作液。

按设定的色谱条件依次进样测定标准工作液，记录各单糖的峰面积；以标准工作液的浓度（x，单位mg/mL）为横坐标，对应的峰面积（y）为纵坐标，绘制各单糖的标准曲线，计算回归方程（如葡萄糖的回归方程为y=1234x+56，要求相关系数R²≥0.999，确保线性关系良好）。

样品测定与质控

将待测样品溶液注入高效液相色谱仪，记录各单糖的色谱峰面积（如葡萄糖的保留时间约为8分钟，木糖约为10分钟）；根据各单糖的标准曲线回归方程，计算待测样品溶液中各单糖的浓度（记为cᵢ，单位mg/mL）。

质控要求：每测定5个样品后，需注入一次0.2mg/mL的标准工作液，若峰面积偏差超过5%，需重新校准色谱系统（如冲洗色谱柱、调整流动相流速），确保检测结果的稳定性和准确性。

结果计算

总膳食纤维（TDF）的含量计算公式为：TDF（%）= [Σ（cᵢ×V×fᵢ×0.9）/m]×100%。其中：cᵢ为待测样品溶液中第i种单糖的浓度（mg/mL）；V为水解液的定容体积（100mL）；fᵢ为第i种单糖对应多糖的换算系数（如葡萄糖对应葡聚糖，fᵢ=1；木糖对应木聚糖，fᵢ=1）；0.9为单糖脱水缩合为多糖的系数（单糖分子量约180，多糖重复单元分子量约162，162/180=0.9）；m为样品的称样质量（g）；Σ为各单糖对应的多糖含量之和。

注意：若样品中含有木质素（如木质化程度高的蔬菜、谷物外皮），需单独用酸-碱法测定木质素含量，并将其加入总膳食纤维的结果中——因为木质素无法被硫酸水解为单糖，无法通过HPLC法检测。