生物检测

冷冻样本是蛋白质修饰分析（如磷酸化、乙酰化、泛素化等）中最常用的生物材料，其预处理环节直接影响修饰位点的鉴定灵敏度与定量准确性。第三方检测机构需通过标准化流程，兼顾样本的生物活性保留、杂质去除及修饰特异性富集，确保后续质谱分析结果的可靠性。本文围绕冷冻样本蛋白质修饰分析的预处理步骤，详细阐述第三方检测的关键操作与注意事项。

样本接收与核对：源头把控样本质量

第三方检测机构接收冷冻样本的第一步、「信息核对+状态评估」。需逐一核对送检单与样本管的标识一致性，重点确认样本类型（如细胞沉淀、肝组织块、血浆）、冻存温度（-80℃或液氮）及保存时间是否符合协议要求。例如，若送检方声称样本为「-80℃保存的细胞沉淀」，但实际收到的样本管标签显示「-20℃保存1个月」，需立即联系送检方确认，避免因保存条件不当导致蛋白质降解。

同时，需检查样本的物理状态：细胞或组织样本需观察管壁是否有反复冻融的痕迹（如冰结晶、管壁结霜）；血清/血浆样本需确认是否分离完全（无红细胞沉淀或纤维蛋白凝块）。若发现样本管有裂纹、标签模糊或冻存液泄漏，需拍照记录并反馈送检方，必要时要求重新送检——此类样本即使勉强处理，后续修饰分析也可能出现假阳性或定量偏差。

对于组织样本，还需确认是否按要求预处理：如小鼠肝脏组织需分割为10-20mg的小块（便于快速冻融），若收到的组织块过大（＞50mg），需告知送检方后续匀浆可能不充分，影响蛋白质提取效率。

冷冻样本的解冻处理：快速解冻+低温保持

冷冻样本的解冻方式直接影响蛋白质完整性。第三方检测需遵循「快速解冻、低温保持」原则：-80℃保存的细胞沉淀或组织块，需置于4℃冰浴中缓慢解冻（约10-15分钟），避免37℃水浴过度升温导致蛋白质变性；液氮保存的组织样本，需先在-80℃冰箱中放置30分钟过渡，再转移至冰上解冻，防止温度骤变破坏细胞结构。

血清/血浆样本的解冻需更谨慎：可在37℃水浴中快速摇晃（1-2分钟）至完全融化，随后立即转移至冰上——若解冻时间超过5分钟，血清中的蛋白酶可能激活，导致蛋白质修饰位点改变。解冻后的样本需在30分钟内进行蛋白质提取，若无法及时处理，需再次冻存于-80℃，但需标注「已解冻1次」，且后续分析时需说明冻融次数对结果的影响。

需注意：严禁将冷冻样本直接置于室温解冻，也不可反复冻融（超过3次会导致蛋白质降解率显著上升）。若送检方提供的样本已冻融2次，第三方检测需在报告中注明「样本存在多次冻融风险」，提醒送检方关注结果可靠性。

蛋白质提取：适配样本类型的裂解策略

提取后的蛋白质需先变性，使蛋白酶能充分作用于肽键。通常加入5mM DTT（二硫苏糖醇），56℃孵育30分钟还原二硫键；再加入15mM碘乙酰胺，暗处室温孵育30分钟烷基化巯基（避免蛋白质重新形成二硫键）。需注意：DTT和碘乙酰胺需现配现用，避免氧化失效。

变性后的蛋白质需调整尿素浓度至≤2M（胰蛋白酶的最适浓度），随后加入序列级胰蛋白酶（Trypsin，酶:蛋白=1:50，w/w），37℃恒温摇床孵育12-16小时。酶解时间需严格控制：若孵育时间不足，蛋白质未完全切成肽段，会导致修饰位点漏检；若时间过长，胰蛋白酶可能自切，产生非目标肽段。

酶解完成后，需用0.1%甲酸终止反应，随后通过C18固相萃取柱（SPE）脱盐：将肽段溶液上样至预处理后的SPE柱，用含0.1%甲酸的水冲洗3次（去除盐、尿素等杂质），再用含80%乙腈的0.1%甲酸溶液洗脱肽段。脱盐后的肽段需真空离心浓缩至100μL，备用。

修饰特异性富集：锁定目标修饰类型

修饰特异性富集是蛋白质修饰分析的关键步骤，需根据目标修饰选择对应的方法。以磷酸化修饰为例，常用TiO2微球富集：将脱盐后的肽段溶解于含2% TFA和60%乙腈的缓冲液中，与TiO2微球（10μg/μg肽段）混合孵育30分钟（室温，摇晃）；随后用含1% TFA的乙腈溶液洗涤3次（每次5分钟），去除非磷酸化肽段；最后用含5%氨水的溶液（pH10.5）洗脱磷酸化肽段，并用甲酸中和至pH7.0。

乙酰化修饰则采用免疫富集法：将肽段溶解于免疫沉淀缓冲液（50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、0.1% Triton X-100）中，加入乙酰化赖氨酸特异性抗体（如CST的Ac-Lys Antibody），4℃孵育过夜；次日加入Protein A/G磁珠，室温孵育1小时捕获抗体-肽段复合物；用洗涤缓冲液（含0.5M NaCl的免疫沉淀缓冲液）洗涤3次，再用0.1M甘氨酸-HCl（pH2.5）洗脱乙酰化肽段，最后用1M Tris-HCl中和至中性。

需注意：富集过程中需控制缓冲液的pH值与盐浓度——如TiO2富集磷酸化肽段时，pH值需＜3（增强TiO2与磷酸基团的结合）；免疫富集时，盐浓度需适中（150mM NaCl），避免过高导致抗体与肽段解离。

富集后处理：去除残留杂质与浓缩

富集后的肽段需进行二次脱盐，去除残留的盐、洗涤剂或抗体片段。常用C18 ZipTip：将ZipTip浸入脱盐缓冲液（0.1%甲酸）中平衡3次，再吸取富集后的肽段溶液，缓慢推出（让肽段结合到C18填料上）；随后用0.1%甲酸冲洗3次，去除杂质；最后用含80%乙腈的0.1%甲酸溶液洗脱肽段，收集洗脱液。

脱盐后的肽段需真空离心浓缩至10-20μL（浓度≥0.5μg/μL），确保符合质谱进样要求。若浓缩过程中出现沉淀（如肽段浓度过高），可加入少量乙腈（终浓度10%）溶解，避免沉淀堵塞质谱进样针。

此外，需对富集后的肽段进行初步质量评估：取1μL肽段溶液，用MALDI-TOF质谱检测肽段分子量分布——若肽段主要集中在800-3000Da（胰蛋白酶酶解的典型范围），说明富集效果良好；若出现大量＞3000Da的峰，需重新进行酶解或富集。

预处理中的核心注意事项

首先是「抑制酶活性」：整个预处理过程需加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，且所有操作在4℃或冰上进行。例如，若分析磷酸化修饰，需避免样本接触金属离子（如Fe³⁺），防止磷酸基团被水解；若分析乙酰化修饰，需避免使用含去乙酰化酶的试剂（如某些裂解液中的Tris）。

其次是「避免交叉污染」：处理不同样本时需更换新的枪头、离心管和Tip头，操作台面需用75%乙醇擦拭消毒。例如，处理完「磷酸化肽段富集」的样本后，需彻底清洁磁珠分离器，再处理「乙酰化肽段富集」的样本，避免磷酸化肽段污染乙酰化样本。

最后是「记录全程数据」：第三方检测需详细记录每个步骤的操作时间、试剂批号、离心参数及样本状态（如酶解前蛋白质浓度、富集后的肽段体积）。这些数据不仅能用于结果溯源，还能在出现问题时快速定位原因（如某样本修饰位点鉴定率低，可回溯是否因酶解时间不足导致）。