生物检测

动物模型是生物医药研究中模拟人类疾病、验证药物靶点的核心工具，而蛋白质定量分析作为揭示生命活动分子机制的关键技术，直接影响研究结论的可靠性。随着研究精细化需求提升，越来越多团队选择第三方检测服务，但合作流程的不清晰常导致效率损耗。本文围绕动物模型蛋白质定量分析第三方服务的全流程，从需求沟通到报告解读逐一拆解，为科研人员提供可操作的合作指引。

需求确认与项目评估

合作的第一步、明确双方需求边界，科研人员需向第三方机构提供3类核心信息：动物模型详情（如物种、建模方法、造模周期）、样本信息（组织部位、采集时间点、保存条件）、检测需求（靶蛋白列表、定量技术偏好、数据精度要求）。例如，若研究糖尿病小鼠模型的胰腺组织胰岛素定量，需说明小鼠品系（如db/db小鼠）、造模周龄（8周 vs 12周）、胰腺样本采集方式（是否冰上解剖、立即液氮速冻），以及是否需同时检测胰岛素原等相关蛋白。

第三方机构会基于这些信息开展项目评估：首先验证技术可行性——如针对低丰度细胞因子，需确认质谱平台灵敏度是否满足；其次评估样本兼容性——若样本是长期-80℃保存的血清，需检查蛋白降解风险；最后给出成本与周期预估——比如10个样本的TMT标记定量蛋白组学，通常需2-3周实验时间，成本包含样本处理、质谱检测、数据解析等环节。

此阶段需避免“模糊需求”，比如仅说“检测小鼠肝脏蛋白”而不说明模型类型，可能导致机构推荐不匹配的前处理方法（如纤维化肝脏需调整裂解液成分）。建议科研人员提前用表格整理关键参数，减少沟通反复。

部分机构会要求签署“需求确认函”，明确双方责任：如科研人员保证模型信息真实性，机构承诺技术路线合理性。这是后续合作的基础，务必细致核对。

样本制备与运输指导

样本质量直接决定检测结果可靠性，第三方机构会提供《样本制备指南》，核心要点包括：组织样本需在采集后10分钟内液氮速冻，避免蛋白降解；裂解时根据组织类型选裂解液（如脑组织用NP-40更温和，肌肉组织需加玻璃珠研磨）；蛋白定量用与后续检测匹配的方法（如WB用BCA法，质谱用Bradford法避免去污剂干扰）。

例如，小鼠海马组织制备需遵循：解剖后立即液氮速冻，-80℃保存；裂解时按1:10（w/v）加含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上研磨30分钟；12000g离心15分钟取上清，BCA法测浓度后分装为50μL/管。

运输环节需注意：干冰用量需满足运输时间的1.5倍（如24小时运输用5kg干冰）；样本管需Parafilm封口防漏；外包装标注“生物样本”“低温运输”警示语。部分机构提供上门取件或冷链合作，确保样本全程-70℃以下。

若样本不符合要求（如反复冻融的组织、蛋白浓度过低的血清），机构会提前告知并建议重新制备，避免实验失败。科研人员有疑问需及时咨询，比如“裂解液中PMSF需现用现加吗？”，机构会给出针对性解答。

检测方案定制与确认

基于需求与样本评估，机构会定制个性化方案。若需求是特定靶蛋白定量（如心肌组织BNP蛋白），方案包含：抗体选择（种属验证的单抗）、WB流程（上样量、电泳条件、转膜时间）、内参选择（心肌组织用α-actin）、重复次数（3次生物学重复+2次技术重复）。

若需求是全蛋白组定量，方案涉及：质谱平台选择（如Q Exactive HF-X）、前处理方法（FASP酶解、高pH反相分级）、定量策略（TMT标记 vs label-free）。例如，10个糖尿病小鼠肝脏样本推荐TMT10-plex标记+高pH分级，预计鉴定8000+蛋白，减少批次效应。

方案确认需核对3点：质控指标（WB条带CV≤10%、质谱FDR≤1%）、试剂溯源性（抗体来自CST/Abcam等品牌）、实验变量控制（同一批实验用同一批次试剂）。科研人员若疑问“为何选TMT而非label-free”，机构需解释：TMT更适合多样本同时分析，减少批次效应。

确认后签署《检测服务协议》，明确方案、费用、周期、保密条款（样本与数据保密）。这是实验“施工图”，需避免模糊表述。

实验执行与质量控制

机构收到样本后首先“样本验收”：核对编号与数量，检查状态（如组织是否融化、血清是否沉淀），拍照留存。合格则进入实验，不合格立即通知并协商解决方案。

实验过程中质控贯穿始终：WB实验每块胶加“阳性对照”（已知靶蛋白样本）和“阴性对照”（敲除靶蛋白样本），确保抗体特异性；设技术重复（同一样本上样2次），CV>15%则重测。

质谱实验质控包括：每10个样本插入1个“Pooled QC”（所有样本混合液），监控保留时间稳定性与肽段鉴定数一致性；用“标准蛋白混合物（UPS1）”验证定量准确性，低丰度蛋白回收率≥80%。

机构会记录《实验日志》，包含试剂批号、仪器参数、操作时间、质控结果等。科研人员可随时查看，了解实验进展。

数据处理与初步分析

实验完成后，机构对原始数据标准化处理。WB数据流程：ImageJ读条带灰度值→减背景值→内参校正（如GAPDH）→计算相对表达量→生物学重复的均值与标准差。

质谱数据处理更复杂：用MaxQuant解析谱图，匹配Uniprot数据库；过滤FDR>1%的肽段/蛋白，去除仅1条肽段的蛋白；归一化处理（TMT用全局归一化，label-free用中位数归一化抵抗极端值）。

初步分析针对需求展开：差异蛋白筛选（倍数变化>1.5、P<0.05）用火山图展示；通路分析用GO/KEGG富集，找出差异蛋白涉及的信号通路（如糖尿病模型的“胰岛素信号通路”）。

机构会生成《数据中间报告》，包含原始数据、处理流程、初步结果。科研人员若疑问“为何用中位数归一化”，机构需解释：更能抵抗极端值，适合样本差异大的情况。

报告交付与解读沟通

数据确认无误后，机构交付正式《检测报告》，内容包括：1、项目概况（委托方、实验目的、样本信息）；

2、实验方法（技术路线、试剂、仪器、质控）；

3、结果呈现（WB条带图、质谱总离子流图、差异蛋白火山图）；

4、统计分析（均值、标准差、P值、倍数变化）；

5、结论与建议（关键结果总结、后续研究建议）。

报告交付后，机构安排1-2次解读沟通：技术人员讲解关键内容（如“db/db小鼠胰腺胰岛素表达比野生型低60%，P<0.01”“肝脏差异蛋白富集脂质代谢通路”）；解答疑问（如“质谱与WB结果不一致的原因”——可能是检测的蛋白形式不同，或样本处理差异）。

若对报告有异议（如“条带灰度计算有误”），机构需3个工作日内核对原始数据与流程并回复。建议科研人员提前整理疑问清单（如“差异蛋白A为何表达升高”），提高沟通效率。

后续服务与问题回溯

合作完成后，机构提供后续服务：样本保存（剩余样本-80℃存3个月，延长需书面申请）；数据二次分析（如蛋白组与转录组关联的WGCNA分析）；技术咨询（论文写作中结果解释问题）。

若后续研究发现结果异常（如论文评审要求验证某蛋白），机构可协助回溯：查看《实验日志》确认操作规范，重新分析原始数据，或用留存样本重测验证重复性。

例如，某团队论文返修时需验证“ATP合酶亚基α”的差异，机构可取出留存样本用WB重测，确认结果一致，帮助快速回应评审。

此阶段重点是“闭环”，确保科研人员合作后仍能获得支持，解决后续问题。