食品检测

AOAC 991.43是国际通行的酶-重量法膳食纤维检测标准，适用于食品中总膳食纤维（TDF）、不溶性膳食纤维（IDF）和可溶性膳食纤维（SDF）的定量分析。其核心原理是通过淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖淀粉酶依次去除淀粉与蛋白质，再经过滤分离IDF、乙醇沉淀收集SDF，最终校正灰分与蛋白质得到纯膳食纤维含量，结果准确且重复性好。

1、样品前处理

首先判断样品脂肪含量：若脂肪＞10%（如坚果、油炸食品），需脱脂处理——称取5.0g样品于具塞锥形瓶，加20mL乙醚（沸点30-60℃）振荡10分钟，倾去醚层，重复2-3次至醚层无色，摊于滤纸挥去残留乙醚。

将样品磨细过40目筛（确保颗粒均匀），称取1.0-2.0g（精确至0.0001g）置于烧杯，加25mL去离子水，用高速均质机（10000rpm）均质2分钟，制成均匀匀浆，转移至250mL锥形瓶。

2、试剂与设备准备

关键试剂需现配现用：① MES-Tris缓冲液（pH6.0）：10.31g MES+5.25g Tris，加800mL水溶解，盐酸调pH至6.0，定容至1000mL；② 耐热α-淀粉酶溶液：12.5g酶（≥10000U/g）用MES-Tris缓冲液定容至100mL；③ 蛋白酶溶液：5g酶（≥300U/mg）用MES-Tris缓冲液定容至100mL，调pH8.0；④ 葡萄糖淀粉酶溶液：1.6g酶（≥1000U/mL）用0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.5）定容至100mL；⑤ 预冷95%乙醇、丙酮。

核心设备需校准：恒温水浴锅（95-100℃、60℃，误差±1℃）、玻璃坩埚（G2孔隙度，铺1mm硅藻土滤层，105℃干燥2小时称重记为m0）、真空抽滤装置（负压≥0.08MPa）、pH计（精度0.01）、电热干燥箱（105℃±2℃）、马弗炉（525℃±5℃）。

3、淀粉水解（α-淀粉酶处理）

向样品匀浆加10mL预热至60℃的耐热α-淀粉酶溶液（按每克样品10mL调整），摇匀后放入95-100℃水浴锅，水面没过样品液面，保温30分钟。

期间每10分钟搅拌1次（避免淀粉结块），保温结束后立即浸入冰水冷却至60℃，防止酶继续作用。取1滴样品加碘液，若不变蓝说明淀粉初步水解完全。

4、蛋白质去除（蛋白酶处理）

向60℃样品加10mL蛋白酶溶液，用pH计测pH，若偏离8.0，用1mol/L氢氧化钠缓慢调至8.0（避免局部过碱失活）。

放回60℃水浴锅保温30分钟，每10分钟搅拌1次。结束后复测pH，若降至7.5以下需补调至8.0，确保蛋白质完全水解为氨基酸。

5、剩余淀粉去除（葡萄糖淀粉酶处理）

加10mL葡萄糖淀粉酶溶液，用1mol/L盐酸调pH至4.5，搅拌均匀后继续60℃水浴30分钟。

保温结束后，取1滴样品加碘液，若不变蓝则淀粉完全去除；若变蓝需补加5mL酶液，延长保温15分钟至碘液检测阴性。

6、不溶性膳食纤维（IDF）的分离与洗涤

将样品倒入预称重的玻璃坩埚，开启真空泵抽滤，收集滤液（转至500mL烧杯，用于SDF提取）。用70℃热水洗涤滤渣3次（每次20mL），去除残留酶与葡萄糖；

再用95%乙醇洗涤2次（每次15mL，溶解水分），最后用丙酮洗涤2次（每次15mL，加速干燥）。抽滤时控制速度，避免滤渣被抽紧影响洗涤效果。

7、可溶性膳食纤维（SDF）的沉淀与收集

向滤液加4倍体积预冷95%乙醇（如滤液200mL，加800mL乙醇），搅拌1分钟后封保鲜膜（扎孔透气），4℃静置1小时使SDF完全沉淀。

用另一预称重玻璃坩埚（m0’）抽滤沉淀，同样用95%乙醇、丙酮各洗涤2次，操作同IDF洗涤。

8、干燥与初始称重

将IDF与SDF坩埚放入105℃干燥箱，开门10分钟排湿后关闭，干燥过夜（约16小时）至恒重（两次称重差≤0.001g）。

取出置于干燥器冷却30分钟，称重记为m1（IDF坩埚+残渣）、m2（SDF坩埚+残渣）。

9、灰分校正

将IDF与SDF残渣转移至瓷坩埚（或直接用耐温玻璃坩埚），记录瓷坩埚重量m瓷。放入马弗炉，从低温升至525℃保持4小时，使有机物质完全灰化。

冷却后称重记为m灰，灰分质量A=m灰-m瓷（IDF）、B=m灰’-m瓷’（SDF）。

10、蛋白质校正

取0.5g IDF/SDF残渣，用凯氏定氮法测氮含量：加5g硫酸钾、0.5g硫酸铜、10mL浓硫酸消化至澄清，蒸馏收集氨，硼酸吸收后盐酸滴定。

氮含量=（滴定体积×盐酸浓度×14.01）/样品重量×100，蛋白质含量P=氮×6.25（IDF）、Q=氮×6.25（SDF）。

11、结果计算

IDF含量（%）=[(m1-m0)-A-P]/样品重量×100，其中m0为IDF坩埚初始重量；

SDF含量（%）=[(m2-m0’)-B-Q]/样品重量×100，m0’为SDF坩埚初始重量；

总膳食纤维（TDF）=IDF+SDF，结果保留两位小数。