生物检测

蛋白质定量分析是生命科学研究、疾病标志物发现及药物靶点验证的核心技术支撑。传统单一的半定量（如Western Blot）或定量方法（如液相色谱-质谱联用）存在“通量与精准度”的矛盾——半定量适合快速筛选差异蛋白但无法提供绝对浓度，定量技术精准却成本高、通量有限。半定量与定量结合的策略通过“筛选-验证”的逻辑互补优势，而第三方检测机构凭借标准化流程、专业仪器及方法学经验，成为该策略的主要落地载体，满足科研与临床对蛋白定量的高可靠性需求。

半定量与定量蛋白质分析的核心概念区分

半定量分析以“相对信号强度”评估蛋白表达差异，典型技术如Western Blot（WB）、免疫组化（IHC）。以WB为例，通过抗体结合目标蛋白后的化学发光信号灰度值，得出“样本A中蛋白X表达量是样本B的2倍”这类相对结论，优势是操作简单、成本低，但结果易受抗体特异性、曝光时间影响，无法给出绝对含量。

定量分析聚焦“绝对浓度”测量，核心技术包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的靶向方法（如MRM多重反应监测、PRM平行反应监测）及标记定量（如iTRAQ、TMT）。以MRM为例，通过捕捉目标蛋白的特征肽段离子信号，结合标准曲线计算蛋白绝对浓度（如ng/mg蛋白），优势是精准度高、可同时分析多蛋白，但需已知蛋白序列、仪器成本高。

两者核心差异在于“量化维度”：半定量是“相对差异”，适合“找差异”；定量是“绝对数值”，适合“定浓度”。

半定量与定量结合的技术逻辑

结合策略的本质是“通量筛选+精准验证”的闭环。科研中需先从海量蛋白中快速识别差异候选蛋白——半定量技术（如WB、iTRAQ标记）可实现高吞吐量筛选，缩小研究范围；但半定量的“相对”属性无法满足机制研究或临床应用的“精准”需求（如标志物浓度阈值），因此需用定量技术（如MRM、PRM）验证候选蛋白的绝对含量，形成“筛选-验证”的可靠链路。

例如肿瘤标志物研究中，先通过TMT标记定量筛选肿瘤与正常组织的差异蛋白（差异倍数>2倍），再用PRM靶向验证大样本中的绝对浓度，既利用了标记定量的通量优势，又通过PRM保证结果精准度。

结合策略还能解决单一方法的“假阳性”问题：WB可能因抗体交叉反应出现假阳性条带，质谱定量可验证条带中的真实蛋白；质谱可能因样本污染出现假阳性峰，WB的分子量匹配可排除干扰。

常见的半定量与定量结合检测策略

1、WB+MRM策略：适用于已知目标蛋白的差异验证。步骤为：样本蛋白提取后电泳分离，WB筛选差异条带，切下条带酶解成多肽，再用LC-MS/MS的MRM模式分析特征离子，结合标准曲线计算绝对浓度。该策略实现“可视化筛选+精准定量”，适合复杂样本中目标蛋白定位。

2、iTRAQ/TMT+PRM策略：适用于未知差异蛋白的大规模研究。步骤为：样本蛋白用iTRAQ/TMT同位素标记后混合，LC-MS/MS筛选差异蛋白（差异倍数>1.5，P<0.05），再针对候选蛋白设计PRM靶向方法，重新分析原始样本计算绝对浓度。优势是“高通量筛选+靶向验证”。

3、IHC+SRM策略：适用于组织样本的空间定位与定量。IHC通过抗体染色显示蛋白在组织中的分布（半定量），激光捕获显微切割（LCM）获取阳性区域细胞，提取蛋白后用SRM（选择反应监测）定量，结合空间信息与浓度信息，适合肿瘤微环境研究。

第三方检测机构的方法学优化要点

第三方检测的核心优势是“标准化”与“专业性”，方法学优化围绕“降低变异、提高重现性”展开：

①样本前处理标准化：统一使用RIPA裂解液+蛋白酶抑制剂，冰上裂解30min、12000g离心15min，避免提取效率差异；血清样本用免疫亲和柱去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白，提高低丰度蛋白检测灵敏度。

②仪器校准与质控：质谱仪定期用标准肽段（如BSA酶解肽段）校准，保证质荷比误差<5ppm；每次检测设置QC样本（混合所有待测样本），监测峰面积相对标准偏差（RSD），要求RSD<15%（表示重现性好）。

③方法验证：对每种结合策略进行线性范围、回收率、精密度验证——如MRM的线性范围需覆盖样本中蛋白浓度（1-1000fmol/μL），回收率>80%，日内精密度RSD<10%，日间精密度RSD<15%。

样本类型对结合检测的影响及应对

不同样本的理化特性差异大，第三方需针对性优化前处理：

①血清/血浆样本：高丰度蛋白占比>90%，干扰低丰度蛋白检测。应对：用Multiple Affinity Removal System（MARS）柱去除高丰度蛋白，或固相萃取（SPE）富集低丰度蛋白；WB选择高亲和力单克隆抗体，减少非特异性结合。

②细胞样本：样本量小（1×10^6细胞仅含约100μg蛋白）。应对：用TCA/丙酮沉淀法富集蛋白（浓度提高10-20倍），或微流控芯片电泳减少样本损耗；PRM检测选择灵敏度高的质谱仪（如Orbitrap Exploris 480），降低检测限至fmol级。

③组织样本：异质性强（同一组织中不同细胞类型蛋白差异大）。应对：用激光捕获显微切割（LCM）获取均质细胞群，或组织匀浆机充分破碎组织；IHC采用组织芯片（TMA）批量检测，提高通量与一致性。

结合检测中的数据相关性验证

半定量与定量结果的相关性是判断策略有效性的关键，第三方通过以下方法验证：

①线性相关性分析：将半定量结果（如WB灰度值）与定量结果（如MRM峰面积）进行Pearson相关分析，要求相关系数r>0.8（强相关）。例如用已知浓度的重组蛋白梯度稀释，分别做WB和MRM检测，验证两条浓度曲线的线性趋势一致。

②标准物质验证：用有证标准物质（如NIST SRM 2383）作为质控样本，同时进行半定量与定量检测，要求半定量差异倍数与定量浓度倍数误差<20%。例如SRM 2383中白蛋白浓度为50mg/mL，WB灰度值与MRM峰面积需均对应该浓度。

③重复样本验证：对同一批样本做3次重复检测，计算半定量与定量结果的变异系数（CV）——要求半定量CV<20%、定量CV<15%，且两次结果的CV差异<5%，确保结果稳定。

结果报告中的关键信息呈现

第三方报告需清晰呈现“方法学细节、质控数据、结果解读”三部分，确保用户可理解与复用：

①方法学细节：明确样本前处理步骤（如“血清用MARS柱去除高丰度蛋白”）、所用技术（如“WB采用鼠抗人CD20单克隆抗体，MRM用Thermo TSQ Quantiva质谱仪”）、关键参数（如“WB曝光时间30s，MRM碰撞能量35eV”）。

②质控数据：包括样本蛋白浓度（BCA法结果）、WB内参一致性（如“GAPDH灰度值CV=8%”）、质谱QC样本峰面积RSD（如“QC样本肽段峰面积RSD=10%”）、方法验证参数（如“线性范围1-1000fmol/μL，回收率92%”）。

③结果解读：直接呈现半定量（如“样本A CD20 WB灰度值是样本B的2.5倍”）与定量结果（如“样本A CD20浓度15ng/mg蛋白，样本B 6ng/mg蛋白”）、相关性分析（如“WB灰度值与MRM浓度相关系数r=0.85”）及统计显著性（如“P<0.01”）。