生物检测

唾液样本因采集无创、易重复，已成为蛋白质组学研究、疾病 biomarker 筛选及药物疗效监测的重要材料。第三方检测机构作为独立的结果提供者，其唾液蛋白质定量分析的技术标准直接决定数据的准确性与互认性——规范的技术流程是确保结果可靠、支撑临床决策与科研结论的核心保障。

唾液样本采集与预处理的标准化要求

唾液采集前需对受检者统一指导：采集前30分钟内禁止进食、饮水、吸烟或嚼口香糖，避免食物残渣、口腔清洁剂干扰蛋白质组分；优先选择晨起空腹静息唾液，让唾液自然流入无菌、无蛋白吸附的聚丙烯容器，避免舌头摩擦容器壁导致细胞裂解。

对于无法采集静息唾液的受检者（如口腔干燥症患者），可使用1%柠檬酸溶液刺激舌尖（轻擦10秒后等待1分钟），采集刺激唾液，但需在报告中注明——刺激唾液的蛋白质浓度（约0.5-2mg/mL）通常高于静息唾液，可能影响结果解读。

采集后2小时内完成预处理：4℃、10000×g离心10分钟，去除细胞碎片与黏液；上清液分装至无酶低吸附管（每管≤1mL），-80℃保存；长途运输需用干冰维持-70℃以下，时间不超过72小时，避免蛋白质降解。

唾液蛋白质提取的技术规范

唾液蛋白质提取需兼顾效率与完整性：常用RIPA裂解液（含1% Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.1% SDS），并添加蛋白酶抑制剂 cocktail（1mM PMSF、5mM EDTA、1μg/mL抑肽酶），抑制内源性蛋白酶降解。

黏蛋白含量高的样本（如口干症患者唾液）需预处理：样本与1M NaCl按1:1混合，室温孵育15分钟破坏黏蛋白聚合结构，再离心提取；上清液用0.22μm滤膜过滤，避免黏液颗粒堵塞后续仪器。

提取效果验证需两项指标：一是BCA法初步定量（蛋白质浓度≥0.05mg/mL，满足检测要求）；二是SDS-PAGE电泳——条带清晰、无拖尾或低分子量碎片，说明提取充分；若条带模糊，需增加Triton X-100至2%或延长裂解时间至60分钟。

提取后的溶液需冰上保存，1小时内完成检测；若无法立即检测，分装后-80℃保存，冻融次数≤3次——反复冻融会导致蛋白质聚集，影响定量结果。

蛋白质定量方法的选择与性能验证

第三方机构需根据样本特点选方法：BCA法是基础选择（线性范围20-2000μg/mL，抗SDS干扰），但对还原剂（如DTT）敏感，需提前透析去除；Bradford法灵敏度高（5-200μg/mL），但受Triton X-100影响，需控制去污剂浓度≤0.1%。

低浓度样本（<0.1mg/mL）推荐荧光定量法（如Qubit），线性范围1-2000μg/mL，抗干扰强；需同时定量与鉴定组分时，用LC-MS/MS法（同位素内标定量），准确性达95%以上，但成本较高。

方法学验证需覆盖4项核心指标：线性范围（r²≥0.99）、回收率（85%-115%）、精密度（日内CV≤10%，日间CV≤15%）、定量限（LOQ≤15μg/mL）。例如，BCA法验证时，需用NIST SRM 927e校准品配制5个浓度点（20、200、500、1000、2000μg/mL），绘制曲线并计算相关系数。

内源性干扰需处理：胆红素（>1mg/dL）用活性炭吸附去除；溶菌酶干扰Bradford法时，添加0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中和——干扰未去除的样本需标注“结果受干扰”。

校准品与质控体系的建立

校准品需用有证标准物质（如NIST SRM 927e牛血清白蛋白），确保量值溯源；校准曲线需5个浓度点（覆盖样本范围），双复孔检测，避免单点校准误差。

质控品需基质匹配：可购买商品化人工唾液（含BSA与黏蛋白），或收集临床混合唾液（60℃灭活30分钟）；每批检测运行低（50μg/mL）、中（500μg/mL）、高（1500μg/mL）三浓度质控品，用Westgard规则判断稳定性。

质控异常时按流程排查：先查试剂（如BCA试剂是否过期），再查仪器（如酶标仪波长是否校准至562nm），最后查操作（如加样量是否准确）——排查后重测质控，正常后方可处理样本。

数据处理与报告的标准化

数据处理先过质控：剔除违反Westgard规则的样本，用校准曲线回归方程计算浓度（如y=0.005x+0.02，y为吸光度），避免手动计算。

数值修约按GB/T 8170：BCA法保留两位小数（如0.56mg/mL），荧光法保留一位小数（如0.6mg/mL）；超出校准范围的样本需稀释重测（稀释倍数注明）；低于LOQ的样本标注“低于定量限”。

报告需含7项内容：样本信息（采集方式、预处理）、检测方法（提取试剂、仪器）、校准品信息（来源、批号）、质控结果（三浓度测定值）、样本结果（均值±标准差）、不确定度（如U=0.05mg/mL，k=2）、结论（符合方法学要求）。

报告需盖CMA/CNAS章，原始数据（吸光度记录、校准曲线）保留5年，便于追溯。

交叉污染的防控要求

实验前清洁仪器：酶标仪用75%乙醇擦拭，管路用0.1% SDS冲洗3次；移液器用滤芯吸头，每样一换——避免高浓度样本污染低浓度样本。

进样顺序按“低到高”：先测健康人静息唾液（低浓度），再测刺激唾液或患者样本（高浓度）；每10个样本插空白对照（PBS），若空白吸光度>0.1（BCA法），需重新冲洗仪器。

试剂分装保存：RIPA裂解液、BCA试剂分装至10mL小瓶，避免反复开盖污染；蛋白酶抑制剂现用现加（PMSF用异丙醇新鲜配制，有效期1周）；台面用500mg/L含氯消毒液擦拭，每周监测环境落菌数≤100cfu/平板。