医疗检测

化妆品凝胶类产品因质地温和、易吸收广泛应用，但皮肤致敏性是其安全评估的核心指标之一。三方检测作为独立安全验证环节，样品制备的规范性直接影响皮肤致敏测试结果的准确性与可靠性。本文围绕凝胶类产品的特性，详细拆解皮肤致敏测试样品制备的关键流程与技术要点。

样品采集与初始预处理

样品采集需保证代表性，应从同一批号的批量产品中随机抽取至少3个独立包装，每个包装取用量不少于50g（满足多轮测试需求）。采集容器需选用与凝胶成分无反应的材质，如高硼硅玻璃或聚丙烯塑料，避免容器溶出物干扰待测成分。

采集后需立即记录样品基本信息，包括产品名称、批号、生产日期、保质期、生产厂家及采集时间，确保溯源性。若凝胶中存在肉眼可见的颗粒或不溶物，需进行低速离心预处理（3000rPm，10分钟），去除机械杂质，但需避免高速离心破坏凝胶的三维网络结构导致活性成分流失。

对于含有挥发性成分的凝胶（如含乙醇的清爽型凝胶），采集后需密封保存，防止挥发性成分挥发影响浓度准确性；若样品温度敏感（如含热敏性植物提取物），需在4℃条件下运输与暂存。

对于含有混悬颗粒的凝胶（如含二氧化钛的物理防晒凝胶），离心后需分别保留上清液与沉淀：上清液用于检测可溶性成分的致敏性，沉淀需研磨成细粉（粒径≤10μm）后，用PBS混悬成10%（w/v）的悬浮液，单独评估颗粒成分的机械致敏性。

基质成分的分离与纯化

凝胶类产品的基质（如卡波姆、羟丙基甲基纤维素）多为大分子聚合物，可能干扰皮肤致敏测试中的细胞或动物模型反应，因此需分离基质与待测活性成分。常用方法为透析法，需根据基质聚合物的分子量选择截留分子量合适的透析袋（如卡波姆分子量约100万Da，可选择截留分子量10kDa的透析袋）。

操作时将样品装入透析袋，用50倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）作为透析介质，4℃下搅拌透析24-48小时，期间每6小时更换一次透析液，确保基质大分子被充分截留，而小分子活性成分（如分子量小于10kDa的植物提取物）进入透析液。

若透析后样品仍存在基质残留，可采用溶剂萃取法进一步纯化：对于水基凝胶，用无水乙醇与样品按3:1（v/v）混合，超声提取30分钟，离心（5000rPm，15分钟）取上清液，通过旋转蒸发去除乙醇，再用PBS复溶至原体积；对于油基凝胶，可选用正己烷作为萃取溶剂，同理去除基质成分。

纯化后需检测基质残留量，可通过蒽酮硫酸法测定碳水化合物类基质的残留（如羟丙基甲基纤维素），或通过酚红比色法测定卡波姆的残留，确保残留量低于测试方法的干扰阈值（通常要求基质残留率<1%）。

对于难以分离的基质（如交联型卡波姆），可采用酶解法：向样品中加入0.1%（w/v）的纤维素酶（针对纤维素类基质）或蛋白酶（针对蛋白类基质），37℃孵育2小时，降解基质大分子，再通过离心去除酶解产物，该方法需确保酶本身无致敏性（通过空白试验验证）。

活性成分的浓度确认

活性成分的浓度是皮肤致敏测试的核心参数，需通过定量分析确认制备后样品的浓度与产品标识一致。常用方法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）或酶联免疫吸附法（ELISA），需根据活性成分的化学性质选择。

例如，对于含甘草酸二钾的凝胶，可采用HPLC法：以C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）为固定相，乙腈-0.1%磷酸溶液（20:80）为流动相，检测波长254nm，用甘草酸二钾标准品绘制标准曲线，计算样品中甘草酸二钾的浓度。

对于含挥发性精油的凝胶（如含薰衣草精油），需采用GC法：以DB-5毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）为分离柱，载气为氦气（流速1mL/min），进样口温度250℃，检测器温度280℃，用薰衣草精油标准品（如芳樟醇、乙酸芳樟酯）定量。

若产品标识中活性成分是复配成分（如多种植物提取物复配），需对每种主要活性成分进行定量，确保所有致敏风险成分的浓度均在可控范围内。若浓度偏差超过10%（如标识0.5%的活性成分实际检测为0.4%），需重新调整样品浓度，或向委托方确认是否为产品批次差异。

赋形剂干扰的排除验证

凝胶中的赋形剂（如防腐剂苯氧乙醇、保湿剂甘油、香料）可能本身具有弱致敏性或干扰测试系统（如抑制细胞增殖），需通过空白试验验证其干扰性。具体方法为制备“去活性成分的基质溶液”（即通过透析或萃取去除活性成分后的样品），作为空白对照进行致敏预试验。

若空白对照在细胞毒性试验中IC50<10mg/mL（或在动物试验中引起皮肤红斑），说明赋形剂存在干扰，需进一步处理：对于小分子赋形剂（如苯氧乙醇），可采用活性炭吸附法，向样品中加入1%（w/v）的活性炭粉末，室温搅拌1小时，过滤去除活性炭，再检测赋形剂残留量；对于大分子赋形剂（如聚乙二醇），可通过超速离心（10000rPm，30分钟）去除。

干扰排除后需再次进行空白试验，确保赋形剂对测试系统无显著影响（细胞毒性IC50≥20mg/mL，动物试验无皮肤反应），方可进入后续步骤。

对于含香料的凝胶（如含人工合成香料），需额外进行香料成分的定性分析（如GC-MS），确认是否含有已知致敏原（如香豆素、丁香酚），若有需单独评估其致敏性，或从样品中去除（如用固相微萃取法）。

样品的稳定性验证

制备好的样品需在测试期间保持稳定，避免活性成分降解或浓度变化。稳定性验证需模拟测试条件，设置两个温度梯度：4℃（冷藏保存）与25℃（室温保存），分别在0小时、24小时、48小时、72小时检测活性成分浓度与PH值。

浓度检测采用与“活性成分浓度确认”一致的方法，PH值用精密PH计（精度±0.01）测定。若浓度变化超过10%（如72小时后浓度从0.5%降至0.4%）或PH变化超过0.5个单位（如从5.5变为6.1），说明样品稳定性不足，需调整保存条件（如-20℃冷冻保存）或现用现配。

对于含有易氧化成分的样品（如含维生素C的凝胶），需在样品中加入0.1%（w/v）的抗坏血酸作为抗氧化剂，或在氮气保护下制备与保存，防止氧化降解；对于含水解敏感成分的样品（如含酯类表面活性剂），需将样品PH调整至5.0（接近皮肤PH），减少水解反应。

稳定性验证需做三次平行试验，取平均值作为结果；若稳定性试验中出现显著波动（如某一时间点浓度骤降），需排查原因（如容器密封不良、温度波动），调整后重新验证。

样品均一性的检测

凝胶类产品易因静置出现分层（如油水分层的emulsion凝胶）或浓度不均，需检测样品的均一性。具体方法为将制备好的样品充分搅拌（磁力搅拌器，100rPm，5分钟）后，从容器的上、中、下三个部位各取1mL样品，分别检测活性成分浓度。

均一性判定标准为三个部位的浓度相对标准偏差（RSD）≤5%，若RSD>5%，需延长搅拌时间（如20分钟）或采用超声处理（40kHz，10分钟），促进样品均匀；对于分层严重的样品，需重新均质（如用高速均质机10000rPm处理2分钟），再检测均一性。

对于含混悬颗粒的凝胶，除检测活性成分浓度均一性外，还需检测颗粒粒径的均一性：用激光粒度仪测定三个部位样品的颗粒粒径分布，要求D90（90%颗粒的粒径小于该值）的RSD≤10%，确保颗粒大小一致，避免机械刺激差异。

均一性检测需重复三次，确保结果稳定；若多次处理后均一性仍不达标，需向委托方反馈产品本身的均一性问题，建议优化生产工艺（如调整乳化剂用量、延长均质时间）。

模拟使用条件的样品处理

实际使用中，凝胶会与皮肤表面的汗液、皮脂接触，可能发生成分变化（如水解、络合），因此需模拟使用条件处理样品。常用模拟液为人工汗液（成分：NaCl 0.5%、尿素 0.2%、乳酸 0.1%，PH5.5），按样品与模拟液1:1（w/v）混合，37℃孵育1小时，模拟皮肤表面的温度与湿度环境。

孵育后需检测活性成分的变化：若为水解敏感成分（如酯类化合物），需用HPLC检测水解产物的含量；若为络合敏感成分（如金属离子），需用原子吸收光谱检测络合态金属的比例。若模拟处理后活性成分含量变化超过20%，需在测试报告中说明模拟条件对结果的影响。

对于涂抹后会成膜的凝胶（如防晒凝胶），需额外模拟成膜过程：将样品均匀涂抹在聚四氟乙烯膜上（厚度约0.1mm），37℃干燥30分钟形成膜，再用PBS浸泡提取成膜后的成分（浸泡时间1小时，温度37℃），作为待测样品，确保测试样品贴近实际使用状态。

对于含透皮促进剂的凝胶（如含丙二醇），需模拟透皮过程：用 Franz扩散池，将样品涂抹在猪皮（或人造皮肤模型）上，接收液为PBS（PH7.4），37℃搅拌24小时，收集接收液作为待测样品，评估透皮后的成分致敏性。

阳性与阴性对照样品的制备

三方检测需设置阳性对照与阴性对照，验证测试系统的有效性。阳性对照选择公认的致敏剂，如二硝基氯苯（DNCB）或己基肉桂醛，需制备成与待测样品一致的基质（如用空白凝胶基质溶解DNCB成0.1%浓度），确保对照与待测样品的基质环境一致。

阴性对照选择无致敏性的空白基质（如去活性成分的凝胶基质）或PBS溶液，制备流程需与待测样品完全一致（如同样的透析、萃取、模拟使用处理），避免操作误差导致对照结果异常。

对照样品的浓度需符合测试方法要求：如OECD 429局部淋巴结 assay中，DNCB的阳性对照浓度为0.1%（w/v），阴性对照为空白基质；若采用体外细胞模型（如h-CLAT试验），阳性对照浓度需调整至能引起显著细胞反应（如CD86表达率≥50%），阴性对照需无细胞毒性（细胞存活率≥80%）。

对照样品需与待测样品同时制备、同时保存，确保试验条件一致；若对照结果不符合要求（如阳性对照无反应、阴性对照有反应），需重新制备对照样品，或排查测试系统的问题（如细胞活力不足、动物健康状况差）。

样品浓度梯度的设置

皮肤致敏测试通常需要设置浓度梯度，以确定致敏的剂量-反应关系。浓度梯度的设置需基于细胞毒性预试验结果：首先用待测样品处理靶细胞（如HaCaT角质形成细胞），培养24小时后用MTT法检测细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50）。

浓度梯度通常设置为IC50的1/2、1/4、1/8（如IC50=100μg/mL，则梯度为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL），或根据产品实际使用浓度设置（如实际使用浓度为0.5%，则梯度为1%、0.5%、0.25%），确保覆盖低、中、高三个暴露水平。

对于无细胞毒性的样品（IC50>200μg/mL），需设置最高测试浓度为产品实际使用浓度的5倍（如实际使用浓度0.5%，则最高浓度为2.5%），以验证高浓度下的致敏性；对于细胞毒性极强的样品（IC50<10μg/mL），需降低最低浓度至IC50的1/16，确保梯度覆盖无毒性到毒性范围。

浓度梯度设置需做三次平行试验，取平均值作为最终浓度；若梯度间浓度差异过大（如相邻浓度差超过2倍），需调整梯度间隔（如改为IC50的1/1.5、1/3、1/6），确保剂量-反应关系的线性。

终样品的包装与标识

制备完成的样品需分装至无菌、密封的容器中，常用容器为螺口玻璃冻存管（2mL）或聚丙烯离心管（15mL），避免样品污染或挥发。每个容器的装量需根据测试需求确定（如细胞试验需1mL/管，动物试验需5mL/管），避免多次开盖导致样品污染。

容器需标注清晰的标识，内容包括：样品编号（如“S-001-01”）、产品名称、活性成分名称及浓度、制备日期、有效期（如“2024-05-20至2024-05-27”）、测试项目（如“皮肤致敏性试验（OECD 429）”）、保存条件（如“4℃冷藏”）。

标识需采用防水、防刮的标签，或直接用马克笔写在容器上（玻璃容器需用耐乙醇的马克笔）；对于冷冻保存的样品，需选用耐低温的标签（如-80℃适用标签），避免冻融后标签脱落。

分装后的样品需按保存条件分类存放（如冷藏样品放4℃冰箱、冷冻样品放-20℃冰柜），并建立库存台账，记录样品的入库、出库时间与使用情况，确保样品的可追溯性。