医疗检测

OECD 429方法（局部淋巴结试验，LLNA）是化学品皮肤致敏性检测的主流方法，以淋巴细胞增殖反应为核心指标，替代传统动物试验，兼具准确性与动物福利优势，广泛应用于三方检测机构的合规评估。本文结合三方检测实践，拆解OECD 429方法的操作流程与关键要点，为检测人员提供可落地的执行指南。

OECD 429方法的核心原理

OECD 429方法基于“皮肤致敏的免疫介导机制”：当化学品穿透皮肤接触朗格汉斯细胞后，朗格汉斯细胞会摄取并处理抗原，迁移至耳后局部淋巴结，将抗原呈递给T淋巴细胞。致敏性化学品会诱导T淋巴细胞大量增殖，增殖水平与致敏强度正相关。

该方法通过检测局部淋巴结中淋巴细胞的放射性标记物（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入量，反映增殖情况。核心指标“刺激指数（SI）”为受试物组与阴性对照组的放射性计数（cPm）比值，SI≥3时判定为致敏阳性，结果客观且可量化。

需注意的是，LLNA仅适用于经皮接触的化学品，挥发性极强或无法在皮肤滞留的样品需先通过预试验验证，避免因样品快速流失导致结果偏差。

实验前的样品与试剂准备

样品处理需优先选择OECD推荐的标准介质：脂溶性样品用丙酮/橄榄油（4:1，v/v）混合液，水溶性样品用生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）。若样品无法溶解，可添加≤10%的二甲基亚砜（DMSO）作为助溶剂，但需验证助溶剂本身无致敏性（助溶剂组SI≤2）。

试剂需提前准备：3H-胸腺嘧啶核苷（放射性比活度约1 mCi/ml，用生理盐水稀释至25 μCi/ml）、闪烁液（需兼容水性样品，如Ultima Gold™）、解剖器械（眼科剪、镊子需高压灭菌）。

仪器校准不可少：实验前用标准源验证液闪计数器的效率（≥80%），检查离心机转速（1500 rPm±50 rPm），确保计数准确性。放射性试剂需存放在铅罐中，避免辐射泄漏。

实验动物的选择与饲养要求

推荐使用6-8周龄雌性CBA/J或BALB/c小鼠，体重18-22 g，同一试验中体重差异≤±20%。这两个品系的局部淋巴结对致敏剂反应稳定，背景数据丰富。

饲养环境需符合GLP要求：温度20-24℃、湿度40%-60%、12小时明暗周期，饲料与饮水灭菌处理。动物购入后需适应5天，每天观察健康状况，淘汰腹泻、消瘦或皮肤损伤个体。

雌性小鼠的动情周期可能影响结果，需选择未交配个体并随机分组，降低周期波动干扰。若周期影响显著，可使用去势小鼠。

诱导阶段的操作步骤

动物分组需设置4组：阴性对照（涂介质）、阳性对照（涂0.5%2,4-二硝基氯苯）、受试物低/高浓度组（至少3个浓度），每组至少5只小鼠，保证统计效力。

给药方式为左耳背面涂抹：固定小鼠后，用移液器取25 μl样品（或介质），均匀涂抹于左耳背约1 cm²区域，避免舔食。每天1次，连续3天，时间固定（如上午9点），保证暴露一致性。

剂量选择基于预试验：预试验确定“最大无刺激性浓度（MIDC）”——涂抹后24小时皮肤无红肿的最高浓度。受试物浓度梯度需覆盖MIDC、MIDC/2、MIDC/4，无刺激性时选50%（w/v）或饱和浓度。

激发阶段的放射性标记与采样

最后一次给药后72小时，腹腔注射250 μl 3H-胸腺嘧啶核苷（20 μCi），注射部位为下腹部左侧，避免注入肠道。注射后禁食不禁水，5小时后安乐死小鼠（二氧化碳吸入法）。

解剖时剪去左耳，分离耳后淋巴结（淡黄色小颗粒，直径1-2 mm），用PBS冲洗去除脂肪。将淋巴结放入含2 ml PBS的平皿，用注射器活塞研磨至组织分散，200目滤网过滤，1500 rPm离心5分钟，弃上清后用1 ml PBS重悬细胞。

需避免淋巴结带脂肪——脂肪会吸附放射性物质，导致cPm值虚高；研磨不充分会破坏细胞，降低cPm值，需确保细胞悬液均匀。

淋巴细胞增殖的检测与数据处理

将细胞悬液转移至液闪计数瓶，加5 ml闪烁液摇匀，液闪计数器计数1分钟/瓶，记录cPm值。计算SI=受试物组平均cPm/阴性对照组平均cPm，SI≥3且有剂量-反应关系时判定致敏阳性。

数据需符合质控标准：阴性对照组cPm需100-500，CV≤20%；阳性对照组SI≥5，否则实验无效。若某组CV＞20%，需重新制备细胞悬液。

若SI≥3但无剂量-反应，需重复试验确认；若所有浓度SI＜3，判定为非致敏性。

质量控制的关键环节

阴性对照稳定性：介质组SI需≤2，组内CV≤15%，确保介质无致敏性。阳性对照有效性：2,4-二硝基氯苯SI需≥5，验证实验体系敏感性。

动物健康监控：诱导阶段每天观察皮肤反应与体重，体重下降＞10%或出现严重刺激的个体需淘汰，避免炎症干扰结果。

仪器与试剂溯源：液闪计数器每周校准，3H-胸腺嘧啶核苷每批检测比活度，闪烁液定期检查透明度。所有操作记录原始数据，包括给药时间、剂量、动物编号等，便于溯源。

常见问题的处理与规避

样品溶解性差：尝试更换介质（如乙醇、DMSO），或制成混悬液（涂抹前摇匀），但需验证介质致敏性。

cPm值异常：若阴性组cPm＜100，可能是胸腺嘧啶核苷注射量不足；若＞500，可能是动物应激（如打架），需排查环境因素。

放射性污染：操作时戴手套与防护镜，用一次性吸管，实验后用70%乙醇擦拭台面，放射性废物放入专用铅罐，按法规处理。