生物检测

大鼠肝脏是生物医药研究常用的组织模型，其蛋白质组分析对肝脏疾病机制、药物代谢等研究具有关键意义。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）作为蛋白质分离的经典技术，能基于分子量实现高效分离，是蛋白质鉴定的基础。本服务方案围绕大鼠肝脏组织的特性，构建标准化SDS-PAGE检测流程，为科研人员提供可靠的蛋白质分离与初步鉴定支持。

样本接收与预处理

服务启动前明确样本要求：大鼠肝脏组织需为新鲜采集后立即液氮速冻或-80℃冻存的样本，禁止反复冻融（反复冻融会破坏蛋白质结构，导致降解）。接收样本后，首先称量100-200mg组织，加入预冷的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂cocktail，抑制蛋白酶活性），使用组织匀浆机在冰上匀浆（转速20000rpm，每次30秒，重复3次），确保组织充分破碎。

匀浆后的样本需在4℃、12000g条件下离心15分钟，取上清液作为蛋白质提取液。随后通过BCA法测定蛋白浓度（浓度需控制在1-5mg/mL）：若浓度过高，用裂解液稀释；若浓度过低，通过真空浓缩仪浓缩，保证后续上样量的一致性。

预处理过程中需全程保持低温（0-4℃），避免蛋白质变性；同时设置空白对照（仅含裂解液），用于排除试剂本底干扰，确保结果的准确性。

试剂与设备准备

核心试剂包括：30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺储备液（比例29:1，用于制备凝胶）、10%SDS溶液（电泳缓冲液与凝胶的关键成分）、Tris-HCl缓冲液（pH8.8的分离胶缓冲液与pH6.8的浓缩胶缓冲液）、10%过硫酸铵（APS，引发凝胶聚合，需现配现用）、TEMED（加速聚合，避免接触皮肤）、5×上样缓冲液（含β-巯基乙醇，用于蛋白变性）、1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（含0.1%SDS，维持电泳环境）。

设备需提前调试：垂直电泳仪（确保胶板密封良好，无漏液）、高速冷冻离心机（4℃预冷）、凝胶成像系统（校准光源与分辨率）、组织匀浆机（消毒并预冷）。

此外，需准备10-250kDa范围的预染蛋白质分子量标准，用于后续分子量比对。

试剂配制需严格遵循要求：丙烯酰胺溶液需避光保存（防止光聚合），SDS用Milli-Q水配制（避免离子干扰），APS与TEMED需在凝胶灌注前立即加入（保证聚合效率）。每批试剂需进行质量验证，如通过空白凝胶电泳检测是否有杂带。

SDS-PAGE凝胶制备

根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度：大鼠肝脏中常见蛋白分子量多在15-100kDa之间，通常选用10%分离胶（配方：30%丙烯酰胺4mL、1.5M Tris-HCl（pH8.8）3mL、Milli-Q水3mL、10%SDS0.1mL、10%APS0.1mL、TEMED0.004mL）；浓缩胶选用5%（配方：30%丙烯酰胺0.83mL、1M Tris-HCl（pH6.8）1.25mL、Milli-Q水7.8mL、10%SDS0.1mL、10%APS0.1mL、TEMED0.008mL）。

制备流程：首先组装胶板（将洁净玻璃片与spacer固定在电泳槽基座），灌注分离胶至胶板高度的2/3处，沿壁缓慢加入无水乙醇（厚度约1cm）压平胶面；待分离胶聚合（约30分钟）后，倒去乙醇，灌注浓缩胶至胶板顶部，立即插入干净梳子（避免气泡）；浓缩胶聚合（约20分钟）后，拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔。

关键控制聚合时间：APS与TEMED的用量需根据室温调整（25℃以上减少用量，15℃以下增加用量），避免凝胶聚合过快导致不均匀；同时胶板需保持垂直，防止凝胶倾斜影响电泳条带的平直度。

样品制备与上样

取预处理后的蛋白质提取液，按1:4比例加入5×上样缓冲液（含5%β-巯基乙醇，还原蛋白质中的二硫键，使蛋白完全变性），充分混匀后，置于沸水浴中煮沸5分钟，然后立即置于冰上冷却（防止蛋白复性）。

上样前将凝胶安装至电泳仪，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（液面需覆盖加样孔）。用微量移液器吸取样品（每孔上样量为20-50μg蛋白，通常不超过20μL），缓慢注入加样孔底部（避免样品溢出或产生气泡）；同时在两侧加样孔加入预染分子量标准（5μL/孔），用于后续分子量比对。

上样注意事项：加样顺序需准确记录（对应样本编号），避免混淆；移液器枪头需避免接触加样孔边缘（防止刮伤凝胶）；若加样孔中有气泡，需用枪头轻轻刺破，否则会导致样品条带扭曲。

电泳操作与参数设置

电泳程序分两阶段：首先以恒压80V运行浓缩胶（电流约10-20mA），直至溴酚蓝（上样缓冲液中的指示剂）进入分离胶（约20-30分钟）；随后调整电压至120V运行分离胶（电流约30-50mA），直至溴酚蓝到达凝胶底部1cm处停止电泳（约60-90分钟）。

电泳过程中需监测参数变化：若电流突然升高，需立即停止电泳并检查（可能因凝胶泄漏或缓冲液不足）。室温电泳时，需用风扇降温避免设备过热；若样本对温度敏感，可采用4℃低温电泳（将电泳槽置于冰箱或连接循环冷却系统），防止蛋白质变性或条带扩散。

关键控制电泳时间：需根据溴酚蓝的迁移位置判断终止时机，避免小分子蛋白跑出凝胶；同时每批实验需保持一致的电泳参数，确保结果的可比性。

蛋白质染色与显影

常规检测采用考马斯亮蓝R-250染色（检测限约0.1μg蛋白）：电泳结束后，取出凝胶置于固定液（40%甲醇+10%冰醋酸+50%水）中固定30分钟（防止蛋白扩散）；然后转移至染色液（0.1%考马斯亮蓝R-250+40%甲醇+10%冰醋酸）中，摇床振荡染色1小时（室温）；接着用脱色液（40%甲醇+10%冰醋酸+50%水）振荡脱色数次（每次30分钟），直至背景清晰、条带明显。

低丰度蛋白检测采用银染法（检测限约0.01μg蛋白）：固定液为50%甲醇+10%冰醋酸+40%水，固定30分钟；用0.02%戊二醛溶液敏化10分钟（增强银离子结合）；Milli-Q水冲洗3次（每次5分钟）；加入银染液（0.1%硝酸银+0.01%甲醛）染色20分钟；再用Milli-Q水冲洗2次（每次1分钟）；最后用显影液（0.04%甲醛+2%碳酸钠）显影，直至条带出现，用终止液（5%冰醋酸）终止反应。

染色后的凝胶需立即成像：使用凝胶成像系统（白光透射模式）拍摄高分辨率图像（至少300dpi），调整曝光时间与对比度（避免过曝或欠曝），并保留预染分子量标准的清晰影像，确保条带分子量测量的准确性。

结果分析与报告输出

结果分析包括两部分：一是分子量鉴定，通过预染分子量标准的条带位置，使用ImageJ等凝胶成像软件测量目标条带的迁移距离，结合标准曲线（log(MW)=a-b×迁移率，a、b为标准曲线参数）计算目标蛋白的分子量；二是半定量分析（若需），通过软件计算条带的积分光密度（IOD），并结合内参蛋白（如GAPDH）校正上样量误差，比较不同样本的蛋白表达量差异。

报告内容需详细完整：包括样本基本信息（编号、来源、保存条件）、实验参数（凝胶浓度、上样量、电泳电压/时间、染色方法）、原始凝胶图像（带样本编号与分子量标准）、分子量对照表（目标条带的迁移距离与计算的分子量）、结果描述（条带的数量、位置、清晰度，是否存在降解或杂带）。若样本存在异常（如条带模糊、降解），需在报告中注明可能的原因（如样本反复冻融、蛋白酶抑制剂失效）。

报告需同时提供原始数据（如蛋白浓度测定结果、电泳参数记录）与图像文件（JPG或TIFF格式），方便科研人员后续分析（如质谱鉴定前的条带切割）。分析过程中需注意，每批实验需同时运行分子量标准，确保条带分子量结果的可比性。