生物检测

干细胞培养上清液富集了干细胞分泌的蛋白质（如细胞因子、生长因子、外泌体蛋白），是研究干细胞旁分泌功能、细胞间通讯及疾病机制的核心样本。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）凭借高灵敏度、高分辨率及高通量特性，成为该类样品蛋白质分离鉴定的金标准。本文结合干细胞上清液的低丰度、复杂性特点，详细阐述从样品前处理到数据分析的完整LC-MS/MS检测方案，聚焦关键步骤的技术细节与质控要点。

干细胞培养上清液的样品前处理

干细胞需培养至对数生长期（汇合度70%-80%），更换为无血清培养基（如DMEM/F12）继续培养24-48小时——无血清条件可避免血清蛋白（如白蛋白、球蛋白）对分泌蛋白的干扰。收集上清液时，用0.22μm无菌滤器过滤或4℃、12000g离心10分钟，去除细胞碎片与微小颗粒物。

上清液中蛋白质浓度通常为μg/mL级，需通过超滤离心管（截留分子量3kDa）浓缩：将上清液加入管中，4℃、4000g离心15-30分钟，至体积浓缩至100μL左右（浓缩倍数根据初始体积调整，如10mL上清浓缩至100μL，浓缩100倍）。

浓缩后样品需脱盐，去除培养基中的盐离子（如NaCl）、小分子代谢物（如葡萄糖）——这些物质会抑制酶解或干扰质谱信号。常用Zeba Spin脱盐柱（7K MWCO），按说明书平衡柱子后加入样品，离心收集流穿液，即为脱盐后的蛋白质样品。

蛋白质的分离与富集

干细胞上清液蛋白质组成复杂（涵盖10-250kDa的蛋白），需先分离以降低质谱检测的复杂度。最常用SDS-PAGE凝胶电泳：取10-20μL脱盐样品，加入等体积2×SDS Loading Buffer（含β-巯基乙醇），煮沸5分钟变性；上样至12%分离胶，恒压80V电泳至溴酚蓝进入分离胶，再调至120V电泳至胶底。

电泳后用考马斯亮蓝R-250染色2小时，脱色液（50%乙醇+10%乙酸）脱色至条带清晰。针对低丰度蛋白质（如细胞因子），可采用TCA沉淀法富集：加入1/9体积100% TCA，4℃静置1小时，12000g离心10分钟，沉淀用冷丙酮洗涤2次，真空干燥后复溶。

蛋白质的还原、烷基化与酶解

蛋白质中的二硫键会影响酶解效率，需先还原、烷基化处理。若为SDS-PAGE分离的胶内蛋白，切取目标条带（如覆盖10-250kDa的条带），剪成1mm³胶粒；用脱色液（50%乙腈+25mM碳酸氢铵）振荡脱色3次（每次15分钟），再用100%乙腈脱水至胶粒发白，真空离心干燥。

向胶粒或溶液样品中加入5mM DTT（溶解于25mM碳酸氢铵），56℃孵育30分钟——DTT作为还原剂，可断裂二硫键（-S-S-）为巯基（-SH）。随后加入15mM碘乙酰胺（溶解于25mM碳酸氢铵），室温避光孵育30分钟——碘乙酰胺可与巯基反应，形成稳定的 carbamidomethyl化产物，避免二硫键重新形成。

酶解采用胰蛋白酶（Trypsin），因其酶切特异性高（切割精氨酸、赖氨酸羧基端），且肽段长度适合质谱检测。按蛋白:酶=50:1（w/w）加入胰蛋白酶（如10μg蛋白加0.2μg酶），37℃孵育过夜（12-16小时）。酶解完成后，胶内样品用提取液（50%乙腈+0.1%甲酸）超声提取2次（每次10分钟），合并提取液；溶液样品直接离心取上清。

肽段的液相色谱（LC）分离

酶解后的肽段需通过液相色谱分离，将复杂肽段混合物按疏水性差异分离，提高质谱检测的灵敏度。常用纳升液相色谱（nano-LC）系统，搭配C18反相色谱柱（如Acclaim PepMap RSLC C18柱，75μm×150mm，2μm颗粒）——纳升流速（300nL/min）可增强肽段与固定相的相互作用，提升分离效果。

流动相配置：A相为0.1%甲酸水溶液（甲酸可增强肽段离子化效率），B相为0.1%甲酸乙腈溶液（乙腈作为有机相，用于洗脱疏水性肽段）。梯度洗脱程序：0-5分钟，2% B（平衡柱子）；

5-45分钟，2%-35% B（线性梯度洗脱，分离不同疏水性的肽段）；

45-50分钟，35%-95% B（洗去强疏水性杂质）；

50-55分钟，95% B（保持洗柱）。

肽段的质谱（MS/MS）检测

分离后的肽段通过电喷雾离子源（ESI）导入质谱仪，采用数据依赖型扫描（DDA）模式——先扫描一级质谱（Full MS）获得所有肽段的质荷比（m/z），再选择信号最强的10个肽段（Top10）进行二级质谱（MS/MS）碎裂，获取肽段序列信息。

质谱参数设置（以Thermo Q-Exactive HF为例）：一级质谱扫描范围m/z 350-1500，分辨率70000 @ m/z 200（高分辨率确保质荷比的准确性），AGC目标3e6（控制离子数目，避免信号饱和），最大注入时间20ms；二级质谱采用高能量碰撞解离（HCD），碰撞能量27%（适中能量可获得丰富的碎片离子），分辨率17500 @ m/z 200，AGC目标1e5，最大注入时间60ms，动态排除30秒（避免重复扫描同一肽段）。

蛋白质鉴定的数据分析策略

质谱原始数据用MaxQuant软件分析，数据库选择与干细胞物种匹配的UniProt数据库（如人类干细胞选UniProt Human Proteome），并添加decoy数据库（反向序列）——通过比较目标序列与decoy序列的匹配数，控制假阳性率（FDR）。

搜索参数：酶切规则为胰蛋白酶（Trypsin/P，允许最多2个漏切位点）；可变修饰包括甲硫氨酸氧化（Oxidation of Met，因甲硫氨酸易氧化）、蛋白质N端乙酰化（Acetylation of Protein N-term，常见翻译后修饰）；固定修饰为半胱氨酸 carbamidomethyl化（Carbamidomethyl of Cys，来自之前的烷基化处理）；肽段质量误差±10ppm，碎片离子误差±0.02Da。

鉴定标准：肽段水平FDR<1%，蛋白质水平FDR<1%；至少2条独特肽段匹配同一蛋白质（或1条独特肽段但结合高置信度评分）。最终输出结果包括蛋白质名称、基因ID、肽段序列、序列覆盖率（如某蛋白被10条肽段覆盖，覆盖率为30%）、相对丰度（如iBAQ值，反映蛋白的相对含量）。

实验过程的质量控制

空白对照：取无血清培养基按照相同流程处理，鉴定到的蛋白质（如培养基中的牛血清白蛋白）需从样品结果中剔除，避免培养基污染。

重复性验证：至少进行3次生物学重复（不同批次的干细胞培养）和2次技术重复（同一批次样品的重复检测）——生物学重复确保结果的生物学意义，技术重复减少仪器误差。

系统稳定性监测：每批实验加入质控品（如牛血清白蛋白酶解肽段，10fmol/μL），监测液相色谱的保留时间（RSD<5%）和质谱的峰面积（RSD<10%）——保留时间稳定说明色谱柱性能良好，峰面积稳定说明质谱信号一致。