生物检测

大鼠作为常用模式生物，其血清蛋白质组学研究在疾病机制、药物开发等领域意义重大。但血清中白蛋白、免疫球蛋白等高丰度蛋白质占比超90%，严重掩盖低丰度功能蛋白（如细胞因子、激酶）的信号，影响后续分析准确性。大鼠血清高丰度蛋白质去除后分离鉴定的检测服务，通过针对性技术手段解决这一痛点，为科研人员提供更精准的蛋白质组数据支撑。

高丰度蛋白质去除的核心技术原理

大鼠血清中高丰度蛋白质（如白蛋白、免疫球蛋白G（IgG）、转铁蛋白）约占总蛋白的90%以上，是蛋白质组学分析的主要干扰源。检测服务中，高丰度蛋白去除的核心技术基于“特异性识别”或“物理化学性质差异”两大原理。其中，免疫亲和层析是最常用的方法——通过将针对白蛋白、IgG的特异性抗体偶联到层析柱上，当血清样本流经柱子时，目标高丰度蛋白与抗体结合被滞留，低丰度蛋白则随流动相流出，该方法的特异性高达95%以上，且对低丰度蛋白的损失较小。

硫酸铵沉淀法则利用蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异：向血清中逐步加入硫酸铵至饱和度为40%~50%时，白蛋白、IgG等疏水性较低的高丰度蛋白会沉淀析出，而低丰度的功能性蛋白（如细胞因子）仍保持溶解状态。这种方法成本低廉、处理量大，但分辨率有限，需结合后续纯化步骤优化。

分子排阻色谱（凝胶过滤）基于蛋白质分子量的差异实现分离：高丰度的白蛋白（分子量约66kDa）、IgG（约150kDa）会先于低丰度的小分子蛋白（如分子量<30kDa的细胞因子）流出柱子，从而实现分离。该方法的优点是操作温和，不会破坏蛋白的结构，但处理量较小，更适合少量样本的精细化处理。

服务提供商通常会根据客户的样本量、目标蛋白类型及实验需求，选择单一或组合技术——例如，对于需要保留完整蛋白活性的样本，优先选择免疫亲和层析；对于大样本量的筛选实验，则结合硫酸铵沉淀与分子排阻色谱，平衡效率与成本。

去除效果的验证策略

高丰度蛋白去除的效果直接影响后续分离鉴定的准确性，因此服务中需通过多维度验证确保结果可靠。首先是蛋白浓度定量：采用Bradford法或BCA法测定去除前后的总蛋白浓度，若去除率达到80%以上（即总蛋白浓度下降至原浓度的20%以下），则满足基本要求。

SDS-PAGE电泳是直观的验证手段：通过对比去除前后的电泳条带，高丰度蛋白对应的条带（如白蛋白的66kDa条带、IgG的50kDa（重链）和25kDa（轻链）条带）应明显减弱或消失，而低丰度蛋白的条带（如10~30kDa的区域）则更加清晰。

Western Blot可实现靶向验证：使用白蛋白、IgG的特异性抗体检测去除后的样本，若条带灰度值较去除前下降90%以上，则说明残留量极低。对于更精准的定量需求，服务商会采用蛋白质组学标记技术（如iTRAQ或TMT），通过质谱定量比较去除前后高丰度蛋白的相对丰度，确保去除率的准确性。

值得注意的是，验证过程中需避免“过度去除”——即不要为了追求高去除率而损失过多低丰度蛋白。例如，若SDS-PAGE结果显示低丰度区域的条带也明显减少，说明可能存在非特异性吸附，需调整层析柱的流速或抗体浓度，优化去除条件。

分离鉴定的技术流程设计

高丰度蛋白去除后的样本，需通过“分离-鉴定”两步流程实现蛋白质组的解析。分离环节的选择取决于样本的复杂性：一维SDS-PAGE适合简单样本（如已富集特定蛋白的样本），通过分子量差异将蛋白分离成条带，再切割条带进行后续鉴定；二维电泳（IEF+SDS-PAGE）则通过等电点（pI）与分子量的双重分离，可将样本中的蛋白分离成数千个点，分辨率更高，适合复杂样本的精细化分析。

液相色谱（LC）是另一种高效的分离手段：反相色谱（RPC）利用蛋白的疏水性差异分离，适合分离极性较低的蛋白；离子交换色谱（IEC）则基于蛋白的电荷差异，适合分离酸性或碱性蛋白。服务中常采用“二维液相色谱”（如RPC与IEC结合），进一步提高分离效果——例如，先通过IEC将蛋白按电荷分组，再用RPC分离每组内的蛋白，可显著降低样本复杂度。

鉴定环节的核心技术是质谱：MALDI-TOF/TOF质谱适合简单样本的快速鉴定，通过检测肽段的质荷比（m/z），与Uniprot大鼠数据库匹配，可在30分钟内得到蛋白列表；LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）则适合复杂样本的深度鉴定，通过将液相色谱分离的肽段直接导入质谱，进行二级碎片离子分析，鉴定的蛋白数量可达数千种，且对低丰度蛋白的检出率更高。

流程设计中需注重“匹配性”：例如，对于去除高丰度后的血清样本（复杂度仍较高），服务商会选择“二维电泳+LC-MS/MS”的组合——二维电泳将蛋白分离成离散的点，减少质谱分析的干扰；LC-MS/MS则对每个点进行深度鉴定，确保低丰度蛋白的检出。而对于已富集的低丰度蛋白样本（如免疫沉淀后的样本），则直接采用MALDI-TOF/TOF质谱，提高检测效率。

样本处理的关键注意事项

样本的采集与前处理是结果可靠的基础，服务中需严格遵循标准化操作。首先是血清采集：大鼠需禁食12小时后，通过腹主动脉取血（避免静脉取血导致的溶血），血液凝固后（室温放置30分钟），以12000g、4℃离心10分钟分离血清，避免细胞碎片混入。

抗凝剂的选择需谨慎：若后续实验需要检测磷酸化蛋白，应避免使用肝素（肝素会抑制磷酸酶活性），优先选择EDTA；若需要保留蛋白的生物活性，则选择citrate抗凝剂。血清采集后需立即分装（每管100~200μL），-80℃保存，避免反复冻融（反复冻融会导致蛋白变性，影响去除效果）。

样本前处理环节：首先通过0.22μm滤膜过滤，去除血清中的颗粒物（如细胞碎片、纤维蛋白凝块）；然后进行蛋白定量（Bradford法），确保每个样本的蛋白浓度在1~10mg/mL之间（浓度过低会影响去除效率，过高则易导致柱堵塞）。

去除高丰度后的样本处理：需通过超滤管（分子量截留3kDa或10kDa）浓缩，将样本体积从1mL浓缩至100μL，提高低丰度蛋白的浓度；随后用PD-10脱盐柱去除样本中的盐离子（如硫酸铵沉淀后的铵离子），避免盐离子对质谱离子源的污染。若样本中存在脂类物质，还需用氯仿-甲醇法去除脂类，确保后续分离的顺畅。

值得强调的是，溶血样本会严重影响结果——血红蛋白（分子量约16kDa）是一种高丰度蛋白，若血清中存在溶血，血红蛋白会替代白蛋白成为新的干扰源，导致低丰度蛋白无法检出。因此，服务中会先对样本进行外观检查，若血清呈红色（溶血）或浑浊（细菌污染），则会建议客户重新提供样本。

低丰度蛋白质的富集技巧

即使去除了高丰度蛋白，低丰度的功能性蛋白（如细胞因子、激酶、生物标志物）的浓度仍可能低于质谱的检测限（约1ng/mL），因此服务中需通过富集技术提高其浓度。免疫沉淀（IP）是针对性最强的方法——使用针对目标低丰度蛋白的特异性抗体，与样本中的蛋白结合后，通过Protein A/G磁珠捕获抗体-蛋白复合物，从而富集目标蛋白。例如，研究大鼠血清中的胰岛素受体底物1（IRS-1，分子量约180kDa，丰度极低），可使用IRS-1特异性抗体进行免疫沉淀，富集后再进行质谱鉴定。

金属螯合色谱（IMAC）主要用于富集磷酸化蛋白：通过将镍、铜等金属离子偶联到层析柱上，与磷酸化蛋白的磷酸基团结合，从而实现富集。该方法的富集效率可达100倍以上，适合研究药物作用后的磷酸化信号通路。

凝集素亲和色谱则用于富集糖蛋白：不同的凝集素（如刀豆凝集素A、麦胚凝集素）可识别不同的糖链结构（如甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺），通过与糖蛋白的糖链结合，富集目标糖蛋白。例如，肿瘤相关的糖蛋白（如CA125）可通过麦胚凝集素柱富集，提高鉴定率。

服务中，富集策略需与客户的研究目标紧密结合——例如，若客户旨在发现糖尿病模型中的生物标志物，服务商会先去除高丰度蛋白，再用IMAC富集磷酸化蛋白，最后通过LC-MS/MS鉴定，聚焦于胰岛素信号通路中的关键蛋白；若客户研究的是病毒感染后的免疫反应，则采用免疫沉淀富集细胞因子（如IL-6、TNF-α），确保目标蛋白的检出。

数据质量控制的标准体系

检测服务的核心是“数据可靠”，因此需建立全流程的质量控制（QC）体系。首先是样本QC：服务商会对每批样本进行外观检查（无溶血、浑浊）、蛋白浓度测定（RSD<10%，即同批样本的蛋白浓度差异小于10%）、完整性检测（SDS-PAGE条带无降解，即没有出现大量小分子碎片条带）。

去除效果QC：除了前文提到的浓度定量、SDS-PAGE、Western Blot验证外，还需通过蛋白质组学定量（如Label-free定量）计算高丰度蛋白的残留率——要求白蛋白、IgG的残留率均<10%，转铁蛋白的残留率<15%，确保低丰度蛋白的信号不被掩盖。

分离鉴定QC：质谱检测的关键指标包括：肽段匹配率（>95%，即质谱检测到的肽段中，95%以上能与数据库中的蛋白匹配）、蛋白质鉴定的假阳性率（FDR<1%，即鉴定到的蛋白中，假阳性结果不足1%）、每个蛋白质的独特肽段数（≥2个，即每个鉴定到的蛋白至少有2个不同的肽段支撑）。

数据报告QC：服务商会提供标准化的报告，内容包括：样本信息（编号、采集时间、处理方法）、去除效果数据（浓度变化、SDS-PAGE图、Western Blot结果）、分离鉴定结果（鉴定到的蛋白列表，包括Uniprot accession号、蛋白名称、分子量、等电点、肽段数、相对丰度）、生物信息学分析（GO功能注释——分为生物过程、分子功能、细胞组分；KEGG通路分析——标注蛋白参与的信号通路，如胰岛素信号通路、MAPK信号通路）。

服务的应用场景举例

大鼠血清高丰度蛋白去除后的分离鉴定服务，已广泛应用于生物医学研究的多个领域。例如，在糖尿病模型研究中，科研人员给大鼠注射链脲佐菌素（STZ）诱导1型糖尿病，采集血清后，通过服务去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白，再用IMAC富集磷酸化蛋白，最后通过LC-MS/MS鉴定到胰岛素受体底物1（IRS-1）的磷酸化水平显著下降——这一结果直接支撑了“STZ通过抑制IRS-1磷酸化导致胰岛素抵抗”的机制假设。

在药物作用机制研究中，某团队研究中药提取物对高血压大鼠的治疗作用，采集给药前后的血清样本，通过服务去除高丰度蛋白后，发现给药组的血管紧张素转换酶2（ACE2，分子量约80kDa）的丰度显著升高——进一步验证表明，ACE2可降解血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），从而降低血压，该结果为中药提取物的作用靶点提供了直接证据。

在生物标志物发现中，某肿瘤研究团队建立了大鼠乳腺癌肺转移模型，采集转移组与对照组的血清样本，通过服务去除高丰度蛋白后，筛选到基质金属蛋白酶9（MMP-9，分子量约92kDa）的丰度在转移组中升高了5倍——后续的临床样本验证表明，MMP-9是乳腺癌肺转移的潜在生物标志物，可用于早期诊断。