医疗检测

ISO 10993是医疗器械生物学评价的核心标准体系，其中ISO 10993-10专门针对皮肤刺激与致敏试验制定了技术要求。随着化妆品行业对安全性评价的精细化需求提升，部分化妆品（尤其是新原料或具有潜在刺激风险的产品）会参考ISO 10993-10的体外试验流程开展第三方检测，以替代传统动物实验。本文将系统解析第三方检测机构依据ISO 10993标准进行化妆品皮肤刺激测试的全流程，为行业理解合规检测逻辑提供参考。

ISO 10993标准在化妆品皮肤刺激测试中的应用定位

ISO 10993最初针对医疗器械的生物学安全性设计，但其关于皮肤刺激的试验方法（如ISO 10993-10）因科学性与规范性，被化妆品行业借鉴用于新原料或高风险产品的刺激评估。与化妆品常规标准（如欧盟CLP、中国GB 7919）不同，ISO 10993-10更侧重体外试验系统的标准化，强调通过重组人表皮模型等替代方法模拟人体皮肤反应，避免动物实验的伦理争议与结果差异。

第三方检测机构选择ISO 10993标准的核心原因在于其对试验方法的严格定义——从试验系统的验证到结果判定的量化指标，均有明确操作指南。例如，ISO 10993-10要求体外皮肤刺激试验必须使用经过验证的重组表皮模型，且模型需符合“与人体皮肤生理结构高度相似”的要求，这为化妆品刺激风险的精准评估提供了技术基础。

需要明确的是，ISO 10993并非化妆品的强制标准，但对于追求高安全性的品牌或需要进入严格监管市场的产品（如欧盟、日本），依据ISO 10993开展第三方检测可作为补充性安全数据，增强产品合规性说服力。

第三方检测前的样品准备与前期沟通

在启动ISO 10993标准的皮肤刺激测试前，第三方检测机构需与委托方完成两项关键准备：样品信息确认与试验方案协商。样品信息需包括：产品名称、原料组成（尤其是活性成分或潜在刺激物）、物理状态（液态/膏状/粉末）、PH值（若为水性产品）、推荐使用浓度等。这些信息直接影响后续试验方法的选择——例如，粉末状样品需先分散于无刺激溶剂（如生理盐水）中，确保与试验系统的接触均匀性。

委托方需向检测机构提供样品的“代表性批次”——即与最终上市产品配方、生产工艺一致的样品，避免因样品差异导致结果偏差。对于新原料，需提供纯度数据（如≥98%）及杂质清单，因为杂质可能干扰刺激试验结果。

此外，双方需明确试验目的：是用于原料备案、产品宣称还是市场准入？不同目的会影响试验设计——例如，若用于欧盟化妆品原料备案（如CPNP），需遵循ISO 10993-10的“体外皮肤刺激试验”要求，且试验系统需被欧盟ECHA认可；若用于国内化妆品新原料注册，则需结合中国《化妆品安全评估技术导则》，补充必要的验证数据。

皮肤刺激测试的核心方法——重组人表皮模型试验

ISO 10993-10推荐的皮肤刺激测试优先选择“体外重组人表皮模型试验”，这是目前化妆品行业替代动物实验的主流方法。该模型由正常人类角质形成细胞体外培养而成，具有完整的表皮结构（包括基底层、棘层、颗粒层与角质层），能模拟人体皮肤对刺激物的屏障反应与细胞毒性应答。

常用的重组表皮模型包括EPiDerm（MatTek公司）、SkinEthic RHE（L’Oréal公司）与LabCyte EPI-MODEL（JaPan Tissue Engineering），这些模型均通过了ISO 10993-10的验证，且被多个国家监管机构（如FDA、EMA）认可。检测机构需选择“与试验目的匹配”的模型——例如，EPiDerm适用于水溶性产品，而SkinEthic RHE更适合脂溶性产品，因后者的角质层更厚，能更好模拟脂溶性物质的渗透。

与传统动物试验（如兔皮肤刺激试验）相比，重组表皮模型试验的优势在于：结果更接近人体皮肤反应（避免种属差异）、试验周期更短（通常2-3天）、数据更可重复（标准化培养条件）。但需注意，该方法仅适用于评估“急性皮肤刺激”（暴露时间≤4小时），若需评估慢性刺激（如长期使用的面霜），需补充其他试验（如重复暴露试验）。

试验系统的验证与可靠性保障

ISO 10993-10要求，用于皮肤刺激测试的重组表皮模型必须经过“实验室内部验证”与“第三方资质认可”。内部验证包括：模型的活力验证（如台盼蓝排斥试验，活细胞率≥90%）、屏障功能验证（如经表皮水分流失率TEWL≤10g/m²/h）、阳性对照响应验证（如用1%十二烷基硫酸钠SDS处理后，细胞存活率≤30%）。

第三方资质认可通常指模型供应商提供的“有效性证书”，或检测机构通过ISO 17025认可的模型验证报告。例如，EPiDerm模型需提供MatTek公司的“Validation Certificate for Skin Irritation”，证明其符合ISO 10993-10的要求。

在试验过程中，检测机构需设置“阳性对照”（如1% SDS）与“阴性对照”（如生理盐水或矿油），以验证试验系统的可靠性。阳性对照的细胞存活率需≤30%，阴性对照的细胞存活率需≥80%，否则试验结果无效，需重新进行。

试验操作的关键步骤与技术细节

ISO 10993-10的体外皮肤刺激试验操作流程可分为四步：模型预处理、样品暴露、细胞活力检测、结果计算。

第一步，模型预处理：将重组表皮模型从培养基中取出，放置于新鲜的维持培养基中，在37℃、5% CO₂培养箱中孵育24小时，恢复模型的生理状态。预处理的关键是确保模型的“水合状态”——若模型过度干燥，会导致样品渗透不均；若过度湿润，则会稀释样品浓度，影响结果准确性。

第二步，样品暴露：根据样品状态选择暴露方式——液态样品直接滴加（0.02ml/cm²），膏状样品均匀涂抹（0.03g/cm²），粉末样品分散后涂抹。暴露时间严格遵循ISO 10993-10的要求：对于化妆品，通常为15分钟（模拟急性接触）或4小时（模拟长时间使用）。暴露过程中，需保持培养箱的湿度≥95%，避免样品干燥。

第三步，细胞活力检测：暴露结束后，用无钙镁PBS缓冲液冲洗模型表面的残留样品，然后加入MTT试剂（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐），在37℃下孵育3小时。MTT会被活细胞的线粒体脱氢酶还原为紫色甲瓒结晶，通过比色法（570nm波长）测定吸光度值（OD值），反映细胞活力。

第四步，结果计算：细胞存活率（%）=（样品组OD值/阴性对照组OD值）×100%。根据ISO 10993-10的判定标准，细胞存活率≤50%时，判定为“具有皮肤刺激性”；>50%则为“无刺激性”。

结果评价与报告的规范化要求

ISO 10993-10要求，皮肤刺激试验的结果评价需基于“量化数据”与“试验系统的有效性”。首先，需确认阳性对照与阴性对照的结果符合要求（如前所述），否则结果无效。其次，需计算样品组的“平均细胞存活率”——至少做3个平行样，变异系数（CV）需≤10%，确保结果的重复性。

对于多成分的化妆品（如面霜），需评价“整体配方”的刺激风险，而非单一成分。若配方中含有已知刺激物（如酒精、果酸），需在报告中说明其浓度与贡献——例如，5%乙醇的细胞存活率为70%，而添加1%水杨酸后，存活率降至45%，则需明确水杨酸是主要刺激来源。

第三方检测机构的报告需包含以下内容：试验名称（如“依据ISO 10993-10的体外皮肤刺激试验”）、试验系统信息（模型名称、供应商、批次号）、样品信息（名称、批次、处理方式）、试验条件（暴露时间、温度、湿度）、原始数据（OD值、平行样结果）、结果判定（刺激性/无刺激性）、试验人员签字与实验室盖章。报告需符合ISO 17025的要求，即“可追溯性”——任何数据修改都需记录修改原因与修改人，确保报告的真实性。

实验室质量控制与合规性管理

依据ISO 10993标准开展皮肤刺激测试的第三方实验室，需满足两项核心资质：ISO 17025认可（检测实验室能力认可）与GLP（良好实验室规范）合规性（若试验用于注册备案）。ISO 17025要求实验室建立“文件化的质量体系”，包括：人员培训（试验人员需具备细胞培养与比色分析经验）、设备校准（酶标仪需每年校准一次，培养箱需每天记录温度与CO₂浓度）、试剂管理（MTT试剂需在-20℃保存，避免失效）。

质量控制的关键环节是“平行试验”与“结果复现”。例如，同一批次样品需做3个平行样，若其中一个样的细胞存活率与平均值差异超过15%，需重新测试该样品。

此外，实验室需定期参加“能力验证计划”（如由CNAS或FDA组织的皮肤刺激试验 Proficiency testing），证明其试验结果与其他实验室的一致性。

对于委托方而言，选择合规的第三方实验室需关注三点：1、实验室是否有ISO 17025证书，且认可范围包含“ISO 10993-10皮肤刺激试验”；

2、实验室是否使用经过验证的重组表皮模型；

3、实验室能否提供完整的试验报告，包括原始数据与方法验证记录。