生物检测

无标记蛋白质定量分析（Label-free Quantification, LFQ）是蛋白质组学核心技术，无需化学标记，通过质谱信号强度直接定量，因成本低、样本兼容性好广泛应用于疾病标志物筛选、药物靶点验证等研究。第三方检测服务凭借专业质谱平台、标准化流程及资深分析能力，成为科研人员高效获取可靠结果的重要选择，技术参数作为评估服务质量的核心维度，直接决定结果的准确性与生物学意义。

样本制备的核心参数要求

无标记定量支持细胞（≥1×10^6个贴壁/悬浮细胞）、新鲜/冷冻组织（≥20mg湿重）、血清/血浆（≥100μL）等样本类型。样本需-80℃冷冻保存，避免反复冻融（≤2次）；血清需通过免疫亲和柱法去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白（占血清蛋白90%以上），细胞/组织需用含蛋白酶抑制剂的裂解液（如RIPA+PMSF）充分裂解，超声辅助破碎后离心（12000g，4℃，15分钟）去除细胞碎片，确保蛋白提取效率≥85%。

检测平台的仪器与联用参数

主流质谱仪如Thermo Fisher Q Exactive HF（分辨率140000 @ m/z 200，质量精度<5ppm，灵敏度达fmol级，可检测低丰度蛋白）、Orbitrap Fusion Lumos（支持更高扫描速度），搭配纳升液相色谱系统（C18反相柱150mm×75μm，粒径1.9μm，柱温40℃），流速300nL/min，流动相为0.1%甲酸水-乙腈体系，梯度洗脱时间90-120分钟。扫描模式为数据依赖型（DDA），即全扫描后选择Top10-20高丰度离子进行二级碎裂（HCD，碰撞能量27-30%），部分平台支持数据非依赖型（DIA）扫描提升肽段覆盖度。

定量准确性的评估指标

重复性用变异系数（CV）衡量：生物学重复（来自不同实验对象的样本，如3只小鼠的肝脏）CV需<20%，反映生物个体差异；技术重复（同一生物样本的多次检测）CV需<10%，反映实验操作稳定性。定量线性范围需覆盖4-5个数量级（从fmol到pmol），确保高、低丰度蛋白均能准确定量。标准蛋白回收率通过“Spike-in”实验验证：向样本中加入已知浓度的重组蛋白（如牛血清白蛋白），回收率需在80%-120%之间，偏离此范围说明样本处理或定量算法存在偏差。

蛋白质覆盖深度与鉴定参数

不同样本类型的蛋白鉴定数目差异显著：细胞样本（如HeLa细胞）可鉴定5000-8000种蛋白，新鲜组织（如肝脏、肿瘤）可鉴定4000-7000种，去高丰度后的血清样本可鉴定2000-4000种。鉴定可靠性要求每个蛋白匹配≥2条独特肽段（仅对应该蛋白的肽段），避免假阳性。低丰度蛋白覆盖能力通过标志性分子验证：如血清中肿瘤标志物CA125（浓度约1-10ng/mL）需稳定鉴定（独特肽段≥2），部分平台可检测到pg/mL级细胞因子（如IL-6）。

数据处理的关键算法参数

核心分析软件为MaxQuant（常用）或Progenesis QI，参数设定包括：酶切方式为胰蛋白酶（Trypsin），漏切位点≤2个；固定修饰为半胱氨酸 carbamidomethylation（碘乙酰胺烷基化，防止半胱氨酸氧化），可变修饰为甲硫氨酸氧化（Methionine oxidation，常见翻译后修饰）。数据库选择Uniprot物种特异性库（如人类Uniprot Reviewed数据库，含≈20000条可信蛋白序列）+常见污染库（cRAP，包含角蛋白、BSA等），肽段与蛋白水平的假阳性率（FDR）均<1%，通过目标-诱饵数据库法控制。丰度值采用中位数归一化：每个样本的蛋白丰度除以该样本所有蛋白丰度的中位数，消除样本间加载量差异。

样本重复的设计与评估参数

无标记定量需设置生物学重复与技术重复：生物学重复≥3次（满足统计检验的最小样本量），反映生物个体间的真实差异；技术重复≥2次，验证实验操作的一致性。重复间相关性通过Pearson相关系数评估：生物学重复的相关系数需>0.85，技术重复需>0.95；若相关系数过低，需排查样本异质性（如实验对象遗传背景差异）或操作误差（如样本制备不均）。异常样本（CV>25%）需排除，避免影响整体结果的可靠性。

实验过程的质量控制参数

通过混合所有待测样本制备“pooled QC”样本，其蛋白组成覆盖所有待测样本，用于监控实验全程稳定性。QC样本的插入频率为每5-10个待测样本插入1个，实验周期超过1天则每天首样运行QC。关键QC指标包括：蛋白峰面积CV<15%（反映质谱信号稳定性）、保留时间RSD<0.5%（反映液相色谱稳定性）、鉴定蛋白数目波动<10%（反映流程一致性）。实时监控总离子流（TIC）：TIC的RSD需<10%，若突然下降或波动过大，需停机检查离子源（如喷雾电压、毛细管温度）或液相系统（如流速、柱效）。

报告输出的标准化参数

报告需包含标准化内容：1、蛋白质鉴定列表（蛋白名、基因名、UniProt ID、物种来源）；

2、定量结果（每个样本的LFQ intensity或iBAQ值，LFQ为相对丰度，iBAQ为绝对丰度）；

3、统计分析（差异蛋白火山图、热图，展示组间丰度变化）；

4、质量控制报告（CV值、FDR、QC样本结果、TIC图）。部分服务提供定制分析：如差异蛋白的KEGG/GO通路富集（P<0.05，FDR<0.1）、蛋白互作网络（STRING数据库），帮助解读生物学意义。