生物检测

生物制药中，蛋白质类药物（如单克隆抗体、重组蛋白）的质量直接取决于分离鉴定过程的精准度。过程控制检测（Process Control Testing, PCT）作为贯穿全流程的质量保障手段，通过实时或离线监测关键参数，确保每一步操作符合预设标准，有效控制杂质、保证产品一致性。本文将拆解蛋白质分离鉴定各环节的过程控制检测要点，为工艺合规性与稳定性提供参考。

蛋白质分离鉴定过程控制检测的核心目标

过程控制检测的本质是“防患于未然”，核心目标包括三点：一是确保目标蛋白的回收率与纯度，避免操作偏差导致产量损失；二是控制工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白、DNA、内毒素）与产品相关杂质（如聚集体、片段）的含量，符合监管要求；三是保证工艺重复性，通过监测pH、电导率等参数的稳定性，确保批次间质量一致。例如，某单抗工艺中，若亲和层析洗脱峰纯度波动超过5%，需立即检查层析柱平衡时间或缓冲液浓度，避免杂质累积。

此外，过程控制需与工艺验证结合——通过多批次数据积累，建立“过程性能确认（PPQ）”标准，如粗提液总蛋白浓度范围、层析洗脱峰UV280峰值区间，这些标准作为日常生产的“警戒线”，超出即启动偏差调查。

分离前的原料与粗提液检测

分离前的原料（如细胞培养液、包涵体溶解液）是分离起点，质量直接影响后续效率。总蛋白浓度用Lowry法或BCA法检测：Lowry法适用于含去污剂的复杂样品，但易受酚类干扰；BCA法更快速，兼容还原试剂。例如，细胞培养液总蛋白浓度通常1-5g/L，若低于1g/L，需调整发酵条件。

目标蛋白含量需针对性选择方法：ELISA适用于已知抗原表位的重组蛋白，定量到ng级；HPLC可同时检测目标蛋白与杂质。宿主细胞蛋白（HCP）用夹心ELISA检测，限度通常<100ppm；DNA用qPCR法，限度<10ng/mg蛋白；内毒素用鲎试剂法（LAL），限度<0.5EU/mg，超标需重新过滤或灭菌。

粗提液浊度通过OD600检测，若高于1.0，说明存在未破碎细胞或沉淀，需重新离心过滤，避免堵塞层析柱。

层析分离过程中的在线与离线检测

层析是分离核心步骤，需结合在线与离线检测。在线检测中，UV280检测器是“眼睛”——目标蛋白含芳香族氨基酸，280nm处有强吸收，通过吸光度变化判断洗脱峰起始与结束。例如，亲和层析中，UV280从<0.1AU升至0.5AU时开始收集，降至0.2AU时停止，避免收集杂质峰。

电导率与pH监测保障层析条件稳定：离子交换层析中，洗脱缓冲液电导率需缓慢上升（如10mS/cm至50mS/cm），若突变需调整泵流速比例；pH需控制在目标蛋白等电点附近（如单抗等电点约8.5，离子交换pH设为7.0），波动超过0.2会导致蛋白结合不稳定。

离线检测聚焦收集峰质量：纯度用SDS-PAGE或毛细管电泳（CE）分析——SDS-PAGE通过条带亮度判断纯度（目标蛋白占比>90%），CE可检测<1%的杂质；浓度用Nanodrop或折光率法；层析介质完整性用BSA测定柱效（理论塔板数N>5000）与对称性（拖尾因子T=0.9-1.1），柱效降至3000以下需再生或更换。

过滤与超滤过程的过程控制

过滤与超滤是浓缩、脱盐步骤，控制重点在“膜完整性”与“过程效率”。过滤环节中，深层过滤去除细胞碎片，除菌过滤（0.22μm膜）用于最终制剂，但滤器完整性需通过气泡点或扩散流试验验证：气泡点试验中，0.22μm膜气泡点需>30psi，低于标准说明膜破损；扩散流速率>标准1.5倍，说明有微小漏洞。

超滤过程中，截留分子量（MWCO）需用标准蛋白验证：如30kDa膜需截留>95%的BSA（66kDa），透过>90%的溶菌酶（14kDa）。浓缩后浓度用折光率法检测（折光率1.335对应10g/L），脱盐后电导率需<1mS/cm，过高需增加洗涤体积（如3倍膜体积增至5倍）。

超滤流速需控制：若从100mL/min降至50mL/min，说明膜表面有蛋白沉积（浓差极化），需搅拌或增加跨膜压力（TMP从1bar增至2bar），但TMP不能超过3bar，避免膜变形或蛋白变性。

电泳与色谱法在中间产物鉴定中的应用

中间产物鉴定需借助电泳与色谱法。SDS-PAGE中，还原型断裂二硫键检测亚基分子量（如单抗重链50kDa、轻链25kDa）；非还原型检测完整分子量（如单抗150kDa）。若还原型出现额外条带（如40kDa重链片段），说明蛋白降解，需检查pH或温度。

毛细管电泳（CE）比SDS-PAGE更灵敏，可定量到pg级，如检测单抗Fab或Fc片段，含量超过2%需调整层析洗脱条件（如增加洗涤缓冲液盐浓度）。

尺寸排阻色谱（SEC）是检测聚集体的“金标准”——聚集体先流出，目标蛋白后流出。单抗聚集体含量通常<1%，若升至3%，说明超滤压力过高或温度超过25℃，需降低压力或控制温度在2-8℃。

质谱技术在蛋白质表征中的过程控制作用

质谱技术（如MALDI-TOF、ESI-MS）用于精准表征。精确分子量测定是基础：ESI-MS检测目标蛋白分子量需与理论值一致（误差<50ppm），如重组人胰岛素理论分子量5808Da，若检测到5824Da，说明多了一个十六酰基，需检查发酵脂肪酶污染。

翻译后修饰（PTM）分析是关键：单抗糖基化修饰影响药效，通过MALDI-TOF检测糖型比例（如G0占40%、G1占30%、G2占20%），若某批次G0升至50%，说明细胞培养葡萄糖不足，需调整发酵液葡萄糖添加量。

肽图分析确认序列正确性：蛋白用胰蛋白酶酶解成肽段，LC-MS检测每个肽段分子量，若缺失某肽段（如20-30位氨基酸），说明蛋白断裂，需回溯粗提步骤检查蛋白酶用量。

杂质分析与控制中的过程检测要点

杂质控制需聚焦“识别-定量-控制”。工艺相关杂质如蛋白酶：用酪蛋白底物法检测活性，超过1U/mg需加蛋白酶抑制剂（如PMSF）；去污剂（如Triton X-100）用比色法检测，限度<0.1%，超标需活性炭吸附或超滤去除。

产品相关杂质如聚集体：用SEC检测，含量高需降低超滤浓缩倍数（如10倍降至5倍）或增加搅拌速度；片段用还原型SDS-PAGE检测，多需延长层析洗涤时间（如5柱体积至10柱体积）。

内毒素用LAL法，微生物限度用平板计数法（<10CFU/mL），若微生物超标，说明除菌膜破损，需重新过滤并验证膜完整性。

法规要求下的过程控制数据完整性

生物制药需符合GMP，数据完整性是合规核心。仪器需定期校准：天平称量10mg样品误差<0.1mg；HPLC柱温箱温度波动<0.5℃；UV检测器用硫酸奎宁验证吸光度准确性（误差<2%）。

数据记录需“可追溯”：每个检测的时间、人员、仪器编号、试剂批号、结果都要记录在LIMS系统中，且不可修改（需审计追踪）。例如，某批次层析洗脱峰纯度85%（标准>90%），记录需注明“偏差原因：层析柱平衡时间不足（20分钟），纠正措施：延长至30分钟重新层析”。

OOS处理需严谨：结果超出标准，先复查样品、仪器、试剂，确认无误后启动CAPA。例如HCP超标，调查发现亲和层析洗涤缓冲液盐浓度不足（0.3M NaCl），CAPA措施是恢复至0.5M并增加洗涤体积至5柱体积。