生物检测

真菌菌丝体蛋白质是研究真菌代谢、致病机制的核心材料，但细胞壁刚性与蛋白酶降解易影响分离效果。冷冻研磨法通过液氮低温破碎细胞壁、抑制酶活，是真菌蛋白研究的关键技术，流程涵盖预处理、研磨、提取、澄清、定量、电泳及酶解等环节，需严格控制参数以保证结果可靠。

真菌菌丝体的预处理

菌丝体需选对数生长期——代谢旺盛，蛋白含量高且稳定，避免 stationary phase 蛋白酶积累。摇瓶丝状真菌用纱布过滤，固体培养用刮勺轻取，避免琼脂杂质。

收集后用预冷PBS洗3次（转速<500g），去培养基残留；无法立即处理的液氮速冻后-80℃保存，抑制蛋白酶。

预处理检查：研磨后考马斯亮蓝染色变蓝，显微镜观察无细胞质泄漏，确保菌丝完整。

例：酿酒酵母3000g离心5min收集，黑曲霉用纱布过滤，避免团聚。

冷冻研磨的设备与参数

冷冻研磨用液氮珠磨机——液氮冷却腔（-196℃），研磨珠振动破细胞壁。丝状真菌用2-3mm氧化锆珠（硬、无金属），酵母用1mm不锈钢珠。

参数：每管50-100mg干重，分3次研磨（每次1min，间隔30s液氮），台盼蓝染色>90%蓝色为破碎完全。

避免：长时间研磨（>5min）生热激活蛋白酶；研磨珠填1/3-1/2管体积，保证撞击。

例：酿酒酵母1mm珠填1/2，磨3次；黑曲霉2mm珠填1/3，磨4次，效果佳。

蛋白质提取液的配制

提取液配方：4M尿素+1M硫脲（破氢键）、2% SDS（溶膜蛋白）、10mM DTT（防聚集）、50mM Tris-HCl（pH8.0）、1%蛋白酶抑制剂。

调整：丝状真菌SDS增至2.5%（膜蛋白多），酵母降1%（避电泳干扰）；加10%甘油稳分泌蛋白。

配制：超纯水，抑制剂临用加（PMSF现配）；提取液预冷4℃，研磨后即加。

pH：8.0-8.5，抑制酸性蛋白酶，配合抑制剂防碱性酶激活。

研磨后匀浆的澄清

研磨后匀浆4℃12000g离心15min，上清为蛋白液，沉淀是细胞壁碎片。

浑浊则重复离心或0.22μm滤膜过滤（膜预润洗防吸附）。

匀浆冰浴<30min离心，室温易激活蛋白酶降解蛋白。

上清分装-80℃，长期加50%甘油，避反复冻融。

蛋白质浓度的定量

BCA法首选——Cu²+与肽键生成Cu⁺，与BCA成紫复合物，562nm测吸光度。兼容SDS，线性20-2000μg/mL。

操作：BSA制标准曲线，样品稀释至范围，37℃孵育30min测吸光。

干扰：高DTT先脱盐，低浓度用增强型BCA。

验证：用50μg/mL BSA测，偏差<10%为可靠。

蛋白质变性与电泳分离

变性：样品加等体积SDS上样缓冲液，沸水浴5-10min，破二级结构，与SDS结合带负电。

电泳：12%凝胶分20-100kDa蛋白，浓缩胶50V，分离胶120V，溴酚蓝到胶底停止。

上样：离心去沉淀，上样10-20μL；甘油沉样品，溴酚蓝示进度。

染色：考马斯亮蓝染2h（灵敏度50ng），低丰度用银染（1ng），需脱银防质谱干扰。

质谱鉴定前的酶解处理

酶解前切胶条（1mm×1mm），用50mM碳酸氢铵+50%乙腈脱色（超声10min×2-3次），至胶块无色。

还原烷基化：加10mM DTT 56℃30min（还原二硫键），吸去后加55mM碘乙酰胺室温避光30min（烷基化巯基，防重新形成）。

酶解：乙腈脱水10min，加20ng/μL胰蛋白酶（50mM碳酸氢铵），4℃渗透30min，37℃孵育过夜。

提取肽段：用50%乙腈+0.1%甲酸超声10min×2，合并液真空干燥，C18 ZipTip柱净化（去杂质，提质谱灵敏度）。