生物检测

ELISA法（酶联免疫吸附测定）是蛋白质定量分析的经典技术，基于抗原-抗体特异性结合与酶催化显色反应，兼具高灵敏度与特异性，广泛应用于生物医药、临床诊断等领域。第三方检测服务依托标准化流程与专业设备，为企业及科研机构提供可靠的蛋白质定量结果，本文结合实际操作场景，梳理ELISA法蛋白质定量分析第三方检测服务的关键步骤与注意事项。

样本准备

样本质量直接影响ELISA结果准确性，第三方检测机构需明确样本类型与处理要求。常见样本包括血清、血浆、细胞裂解液、组织匀浆及培养液上清等：血清样本需采集后室温静置30分钟（避免溶血），4℃ 3000rpm离心15分钟分离上清；血浆样本需使用抗凝管（如EDTA、肝素），采集后立即离心分离；细胞裂解液需采用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（如RIPA），冰上裂解30分钟后，4℃ 12000rpm离心10分钟取上清，去除细胞碎片。

样本保存需遵循“分装-低温”原则：短期保存（≤1周）可放4℃，长期保存需分装至无酶管，-80℃冻存，避免反复冻融（建议不超过3次）。若样本中蛋白浓度过低（如培养液上清），需采用超滤离心管（如3kDa截留分子量）或蛋白浓缩试剂盒浓缩，确保目标蛋白浓度在ELISA检测范围内（通常0.1-100ng/mL）。

样本预处理时需注意：避免使用含叠氮钠的缓冲液（会抑制辣根过氧化物酶HRP活性）；脂肪含量高的样本（如血清）需4℃静置过夜后离心去除浮油；植物样本需去除多酚、多糖等干扰物质（可采用PVPP预处理）。

试剂与设备核查

ELISA试剂需严格核查有效期与保存条件：包被抗体（捕获抗体）、检测抗体（酶标抗体）通常需-20℃分装保存，避免反复冻融；酶底物（如TMB）需避光4℃保存，若出现变色（如蓝绿色）则失效；封闭液（如5%脱脂奶粉）需现配现用，4℃保存不超过1周。

设备需提前校准与调试：酶标仪需验证波长准确性（如450nm、570nm参考波长），使用标准吸光度液（如0.5ABS、1.0ABS）校准；洗板机需检测加液量一致性（误差≤5%），确保每孔加液量为250μL（常规），避免漏洗或多洗；恒温孵育箱需提前30分钟预热至37℃，并验证箱内温度均匀性（温差≤0.5℃）。

此外，需准备无酶耗材（如96孔ELISA板、移液器吸头），避免外源蛋白污染；移液器需定期校准（如每月1次），确保移液体积误差≤2%。

包被与封闭

包被是将捕获抗体固定于ELISA板的过程，常用直接包被法：将捕获抗体用包被缓冲液（如0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至1-10μg/mL（具体浓度需根据抗体亲和力优化），每孔加100μL，4℃过夜孵育（或37℃ 2小时）。包被后需弃去孔内液体，用洗板液（如含0.05% Tween-20的PBS，PBST）洗板1次，去除未结合的抗体。

封闭旨在阻断ELISA板上未结合的蛋白结合位点，减少非特异性吸附。常用封闭液包括5%脱脂奶粉（经济型，适用于多数情况）、1% BSA（适用于对奶粉敏感的抗体）、0.5% Casein（低背景）。封闭液需完全覆盖孔底，每孔加200μL，37℃孵育1小时（或4℃过夜）。封闭后需用PBST洗板3次，每次浸泡1分钟，拍干板底残留液体。

注意事项：包被抗体浓度过高会导致钩状效应（高浓度样本信号抑制），需通过预实验确定最佳浓度；封闭液需避免含干扰物质（如叠氮钠、防腐剂），若样本含生物素，需避免使用含生物素的封闭液。

加样与孵育

标准品需按说明书要求用样本稀释液（如含1% BSA的PBST）倍比稀释，通常制备7-8个浓度梯度（如100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL…0.78ng/mL），每个浓度做复孔（2-3孔）。样本需根据预实验结果稀释至标准曲线范围内，例如血清样本可能需1:100-1:1000稀释，细胞裂解液需1:10-1:50稀释，避免超出线性范围导致结果偏差。

加样时需使用多通道移液器，确保每孔加液量一致（如100μL），加样顺序为：空白孔（仅加稀释液）→标准品（从低浓度到高浓度）→样本孔，避免高浓度样本污染低浓度孔。加样后需轻拍板侧混匀，避免产生气泡（若有气泡需用枪头挑破）。

孵育条件需严格控制：常规采用37℃恒温孵育1-2小时，若抗体亲和力较低，可采用4℃过夜孵育（需密封防止蒸发）。孵育期间避免移动酶标板，确保抗原-抗体充分结合。

洗板操作

洗板是去除未结合物质的关键步骤，直接影响背景值高低。常规使用自动洗板机，设定加液量为250μL/孔，洗板次数3-5次，每次浸泡1分钟。若使用手动洗板，需用移液器逐孔加液，避免漏加，洗板后将酶标板倒扣在干净的吸水纸上（或专用拍板纸），轻拍3次去除残留液体（避免用力过猛导致孔底涂层脱落）。

注意事项：洗板液需现配现用，避免微生物污染（若出现浑浊则弃用）；洗板机需定期维护，清理管路内残留液体（每周用去离子水冲洗1次）；若样本含大量杂质（如细胞碎片），需增加洗板次数（如5次），降低背景信号。

酶标抗体孵育

酶标抗体（结合HRP或AP的检测抗体）需用样本稀释液稀释至工作浓度，稀释比例需严格遵循说明书（如1:2000），避免浓度过高导致非特异性结合。每孔加100μL酶标抗体，37℃孵育1小时（或按抗体要求调整时间）。

孵育后需用PBST洗板3次，方法同前。注意：酶标抗体需避光保存（HRP对光敏感），稀释后需在2小时内使用，避免酶活性降低；若使用生物素-亲和素系统，需先加生物素化检测抗体，孵育后洗板，再加酶标亲和素（如HRP-亲和素），孵育后再次洗板。

底物显色

底物需根据酶标抗体的酶类型选择：HRP常用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物，AP常用对硝基苯磷酸盐（PNPP）底物。TMB底物需避光4℃保存，使用前平衡至室温，每孔加100μL，37℃避光孵育15-30分钟（具体时间根据预实验确定，避免显色过深）。

显色过程需密切观察：标准品高浓度孔应逐渐变为蓝色（TMB），低浓度孔浅蓝或无色；若所有孔均无颜色变化，需检查酶标抗体是否失效或底物是否过期；若背景孔（空白孔）显色，需排查封闭是否充分或洗板是否彻底。

终止反应与读数

当标准品高浓度孔显色至预期深度（如OD值1.5-2.0），需立即加入终止液终止反应。HRP酶系统用2M硫酸（H₂SO₄）终止，每孔加50μL，终止后颜色由蓝变黄；AP酶系统用1M氢氧化钠（NaOH）终止，颜色由黄变橙。终止液需快速加入，避免孔间差异。

终止后需在10分钟内用酶标仪读数，避免颜色褪去。酶标仪需设置主波长为底物对应的波长（TMB为450nm，PNPP为405nm），参考波长为570nm（用于校正孔底不均一性）。读数时需确保酶标板底部干净（无指纹、液体残留），避免影响吸光度值。

数据处理

首先计算复孔吸光度的平均值（OD均值），并扣除空白孔的OD值（背景校正）。标准曲线采用四参数逻辑回归（4PL）拟合（适用于ELISA的S型曲线），或线性回归（若标准曲线在一定范围内线性良好）。拟合时需确保相关系数（R²）≥0.98，表明标准曲线可靠性高。

样本浓度计算：将样本的背景校正后OD值代入标准曲线，得到样本的稀释后浓度，再乘以稀释倍数（如样本稀释100倍，则最终浓度=稀释后浓度×100）。若样本OD值高于标准曲线最高浓度（溢出），需重新稀释样本（如原稀释100倍改为200倍）后复测；若低于最低浓度（未检出），需浓缩样本后复测。

复孔处理需注意：若复孔OD值的变异系数（CV）>10%，需排查加样误差或孵育不均问题，必要时重新检测。

质量控制要点

第三方检测机构需设置多重质控：阳性质控（已知浓度的目标蛋白，如10ng/mL）、阴性质控（不含目标蛋白的样本，如健康人血清）、空白质控（仅含稀释液）。每块板需同时检测质控品，确保阳性质控的OD值在预设范围内（如±2SD），阴性质控的OD值低于cutoff值（通常为空白孔OD值+3SD），空白质控的OD值≤0.1（TMB系统）。

复孔变异系数（CV）需≤10%（同一板内），板间CV≤15%（不同批次实验）。若CV值超标，需排查移液器精度、孵育温度均匀性或洗板一致性问题。

此外，需保留原始数据与实验记录（如试剂批号、孵育时间、酶标仪读数），便于追溯与复核。

常见问题排查

1、背景值高（空白孔OD>0.1）：原因可能是封闭不充分（增加封闭时间或浓度）、洗板不彻底（增加洗板次数或加液量）、酶标抗体浓度过高（降低稀释倍数）、耗材污染（更换无酶板）。

2、信号弱（标准品高浓度孔OD<1.0）：原因可能是包被抗体浓度过低（增加包被浓度）、孵育时间不足（延长孵育时间）、酶标抗体失效（更换新批次抗体）、底物过期（更换底物）。

3、标准曲线线性差（R²<0.98）：原因可能是标准品稀释不准确（使用多通道移液器稀释）、加样误差（校准移液器）、孵育温度不均（检查孵育箱温度）、洗板不一致（校准洗板机）。

4、钩状效应（高浓度样本OD值低于预期）：原因是抗原浓度过高，超过抗体的结合能力，解决方法是增加样本稀释倍数（如从1:100改为1:500）。

5、孔间差异大（同一浓度复孔OD差>0.2）：原因可能是加液量不一致（校准移液器）、孵育箱温度不均（调整孵育位置）、洗板机加液不均（维护洗板机）。