生物检测

CHO细胞是生物制药领域生产重组蛋白（如单克隆抗体、细胞因子）的核心宿主细胞，其培养上清中包含目标重组蛋白、宿主细胞蛋白（HCP）、培养基残留成分及少量杂质蛋白。对上清中蛋白质的分离、鉴定与定量检测，是确保重组蛋白产品纯度、安全性及有效性的关键环节。一套系统的方案需覆盖样本处理、分离、鉴定、定量及质控全流程，以满足法规要求与产品质量控制需求。

样本预处理：去除杂质与稳定蛋白

样本预处理是蛋白质分析的第一步，目的是去除细胞碎片、沉淀及小分子干扰物，同时防止蛋白质降解。首先，将CHO细胞培养上清转移至离心管，于4℃、12000g条件下离心10分钟，去除细胞碎片与不溶性沉淀；随后用0.22μm聚醚砜（PES）滤膜过滤，进一步清除微小颗粒。

对于含高浓度盐或小分子培养基成分的上清，需通过脱盐处理去除干扰：常用PD-10脱盐柱（Sephadex G-25树脂），先用5倍柱体积的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）平衡柱子，上样后用PBS洗脱，收集蛋白质峰（通过紫外吸收280nm监测）。

为避免蛋白质降解，预处理全程需在冰上操作，并添加蛋白酶抑制剂 cocktail（如Roche Complete Mini，按1:100比例加入），抑制丝氨酸、半胱氨酸等蛋白酶活性。处理后的样本可分装冻存于-80℃，避免反复冻融。

蛋白质分离策略：基于理化性质的分层纯化

CHO上清中的蛋白质需通过分离技术富集目标蛋白或去除高丰度杂质，常用方法包括凝胶过滤、离子交换与亲和层析，需根据蛋白质的分子大小、电荷或特异性标签选择。

凝胶过滤层析（分子筛）依赖分子大小分离：使用Superdex 200 Increase 10/300 GL柱子，流动相为PBS（pH7.4），流速0.5ml/min，收集不同保留时间的组分（如目标蛋白分子量大，会先流出）。该方法适合分离聚合体与单体，或去除小分子量杂质。

离子交换层析根据电荷差异分离：对于酸性蛋白（pI<7），选择CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，流动相A为20mM醋酸钠（pH5.0），流动相B为20mM醋酸钠+1M NaCl（pH5.0），通过NaCl梯度洗脱（0%-100%B，30min）；对于碱性蛋白（pI>7），选择DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，流动相为20mM Tris-HCl（pH8.0）与含NaCl的缓冲液。

亲和层析针对特异性标签：若目标蛋白带His-tag，用Ni-NTA琼脂糖树脂，流动相A为50mM Tris-HCl+300mM NaCl（pH8.0），流动相B为A+500mM咪唑，通过咪唑梯度洗脱（5%-50%B，20min）富集目标蛋白；若为抗体，用Protein A/G树脂，流动相为20mM磷酸盐缓冲液（pH7.4），洗脱液为0.1M柠檬酸（pH3.0），中和后得到高纯度抗体。

蛋白质鉴定：LC-MS/MS的高灵敏度分析

分离后的蛋白质需通过质谱鉴定，常用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，流程包括蛋白酶解、液相分离与质谱检测。首先，用胰蛋白酶（酶:蛋白=1:50，37℃孵育16h）将蛋白质酶解为肽段，酶解后用C18 ZipTip脱盐，去除盐与酶解试剂。

液相分离采用纳升液相色谱（nano-LC）：柱子为Acclaim PepMap 100 C18柱（75μm×25cm，3μm颗粒），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱（5%-35%B，60min；

35%-95%B，5min；

95%B保持5min），流速300nl/min。

质谱检测用Q-Exactive HF高分辨质谱：离子源为纳升电喷雾（nanoESI），喷雾电压2.0kV，毛细管温度320℃。采用数据依赖采集（DDA）模式：一级扫描范围m/z 350-1600，分辨率70,000（at m/z 200），选择前20个最强母离子进行二级扫描，碰撞能量27%（HCD），二级分辨率17,500。

数据解析用MaxQuant软件，数据库选择UniProt CHO细胞参考数据库（包含HCP与常见重组蛋白序列），设置肽段FDR<1%、蛋白FDR<1%，匹配肽段数≥2条可鉴定为可信蛋白。

定量检测：标记与非标记技术的选择

蛋白质定量需根据实验需求选择方法，常用Label-free、iTRAQ与SILAC三种技术。Label-free无需标记，通过肽段峰面积或计数定量，适合大样本量分析：需保持液相与质谱参数一致，用MaxQuant的“Label-free quantification”模块，计算蛋白的LFQ intensity，重复性要求CV<20%。

iTRAQ（同位素标记相对与绝对定量）采用4/8重同位素标记试剂，标记肽段的氨基基团：将不同样本的肽段用不同同位素试剂标记（如iTRAQ 8-plex），混合后LC-MS/MS检测，通过同位素峰面积比计算相对含量。该方法适合多组比较（如不同培养时间的上清），定量准确性高，但标记试剂成本较高。

SILAC（稳定同位素标记细胞培养）是代谢标记技术：将CHO细胞培养于含13C6-Lys与15N4-Arg的培养基中，细胞代谢后将同位素掺入蛋白质，上清中的蛋白质带有标记，与未标记样本混合后LC-MS/MS检测，通过质荷比差异定量。该方法适合活体研究，定量准确性最高，但需细胞适应同位素培养基（通常3-5代），成本较高。

对于高丰度目标蛋白（如重组抗体），也可采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量：用特异性抗体包被微孔板，加入上清样本与标准品，通过HRP标记的二抗与底物反应，测450nm吸光度，计算浓度。ELISA适合快速定量，但需高质量抗体。

质量控制：确保结果可靠性的关键环节

内参蛋白选择：需选择在CHO上清中稳定表达、不受培养条件影响的管家蛋白，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）或β-肌动蛋白（β-actin）。需通过Western blot验证：取不同批次的上清样本，检测内参蛋白的条带强度，CV<10%方可使用。

重复性验证：需进行技术重复（同一样本重复检测3次）与生物重复（不同批次细胞培养的上清检测2次），蛋白定量结果的CV值需<15%（Label-free）或<10%（iTRAQ/SILAC）。若CV值过高，需检查液相分离的重复性或质谱参数的稳定性。

FDR控制：肽段与蛋白水平的错误发现率（FDR）需严格控制在1%以下，避免假阳性鉴定。可通过MaxQuant的“decoy database”功能，将正向数据库与反向数据库（氨基酸序列反转）同时搜索，计算FDR。

标准品校准：对于绝对定量，需用已知浓度的重组蛋白标准品（如目标蛋白的标准品）制作标准曲线，覆盖样本中的浓度范围（如0.1ng/μl-100ng/μl），确保定量结果在线性范围内。

干扰因素排除：解决常见问题的方法

培养基成分干扰：若使用含血清的培养基，牛血清白蛋白（BSA）会成为高丰度杂质，干扰低丰度蛋白检测。需更换为无血清培养基，或用Protein A/G树脂去除BSA（BSA可与Protein A/G结合）：将上清与树脂孵育1h（4℃，摇晃），离心去除树脂，收集上清。

蛋白质降解：若样本处理不及时，蛋白质会被蛋白酶降解，导致条带弥散或质谱鉴定到降解肽段。需在收集上清后立即加蛋白酶抑制剂（如PMSF终浓度1mM，EDTA终浓度2mM），并在冰上操作，尽快完成预处理与酶解。

离子抑制：质谱检测中，高浓度盐或极性化合物会抑制肽段的离子化，导致信号减弱。需通过脱盐（如C18 ZipTip）或固相萃取（SPE）去除干扰物，优化上样量（nano-LC上样量500ng-1μg为宜）。

低丰度蛋白检测：上清中的低丰度蛋白（如HCP）易被高丰度目标蛋白掩盖，需用富集方法：如强阳离子交换（SCX）树脂富集酸性肽段，或免疫沉淀（IP）富集特定HCP（用HCP抗体），提高检测灵敏度。

方法优化：提升效率与灵敏度的技巧

液相分离优化：对于难分离的肽段（如疏水性强或碱性肽段），可调整流动相pH：用0.1%三氟乙酸（TFA）代替甲酸，增强疏水性相互作用；或调整梯度斜率，将5%-35%B的洗脱时间从60min延长至90min，提高分离度。

质谱参数优化：调整碰撞能量，用动态碰撞能量（DCX）代替固定碰撞能量，根据母离子的m/z与电荷数计算最佳碰撞能量（如公式：CE=0.05×m/z + 2.5），提高二级谱图的质量；增加扫描次数（如一级扫描分辨率从70,000提高到140,000），提高信噪比。

蛋白富集优化：对于低丰度蛋白，用免疫沉淀富集：将上清与目标蛋白的特异性抗体孵育2h（4℃），加入Protein A/G磁珠孵育1h，洗涤后用0.1M柠檬酸（pH3.0）洗脱，中和后酶解。或用反相柱预富集：将上清过C18固相萃取柱，用5%乙腈洗脱杂质，80%乙腈洗脱蛋白，浓缩后酶解。

酶解条件优化：若蛋白酶解不完全，可调整酶:蛋白比例（如1:20），或延长酶解时间（24h），或加入二硫苏糖醇（DTT，终浓度10mM）还原二硫键，碘乙酰胺（IAA，终浓度50mM）烷基化半胱氨酸，提高酶解效率。