医疗检测

皮肤致敏性是化妆品、化学品等产品安全评估的核心指标之一，直接关系到消费者使用安全。三方检测机构作为独立、公正的第三方，承担着为企业和监管部门提供科学检测数据的重要职责，而局部淋巴结试验（LLNA）是其开展皮肤致敏测试的关键方法之一。本文将深入解析LLNA在三方检测中的原理及具体应用，为行业理解该方法提供参考。

局部淋巴结试验（LLNA）的核心原理

皮肤致敏是一种由T细胞介导的迟发型超敏反应，过程分为诱导相和效应相：诱导相中，致敏原穿透皮肤屏障进入表皮，被朗格汉斯细胞（LC）摄取并加工为抗原肽，随后LC迁移至皮肤引流淋巴结（如耳后淋巴结），将抗原呈递给初始T细胞，引发T细胞增殖；效应相中，增殖的T细胞再次接触相同致敏原时，释放细胞因子导致皮肤炎症。

LLNA正是基于这一机制设计，通过检测引流淋巴结中T细胞的增殖程度定量评估致敏性。试验中，受试物连续3天涂敷于小鼠背部皮肤，第5天处死动物取出引流淋巴结，制备单细胞悬液后加入放射性标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）或荧光标记的溴脱氧尿苷（BrdU）——这些物质会被增殖细胞摄取并整合到DNA中。

最终通过测量放射性活度（cPm）或荧光强度反映细胞增殖水平，核心指标是刺激指数（SI），即受试物组与溶剂对照组的cPm比值，SI≥3通常判定为致敏性阳性。

LLNA与传统皮肤致敏测试方法的差异

传统方法如豚鼠最大化试验（GPMT）、Buehler试验依赖肉眼观察皮肤炎症，属于定性或半定量方法。LLNA则直接检测免疫核心环节（T细胞增殖），结果更客观定量，减少主观误差；且使用小鼠，动物数量更少（每组5-10只），无需激发步骤，降低动物痛苦，符合“3R”原则（替代、减少、优化）。

对三方检测机构而言，LLNA效率更高：传统方法需4-6周，LLNA仅需1-2周，能更快提供报告；且数据重复性好，更易通过监管审核，因此成为皮肤致敏测试的首选。

LLNA在三方检测中的样本处理要求

受试物制备需选择无致敏、无刺激的溶剂（如丙酮/橄榄油4:1），固体需溶解或悬浮，液体需稀释，浓度需覆盖可能致敏剂量——预试验确定最高非毒性浓度，避免细胞毒性干扰。

动物选择雌性CBA/J小鼠（6-8周、18-22g），因对致敏原更敏感；需来自合格供应商，符合SPF级要求，饲养环境满足GLP标准（温度20-24℃、湿度40-60%、12小时光照）。

涂敷操作标准化：背部剃毛至2×2cm，每次涂敷25μL，连续3天，确保受试物与皮肤充分接触；涂敷后观察皮肤是否有红肿，若出现严重刺激需调整浓度。

LLNA的检测流程与结果判定

检测流程分四步：涂敷后第5天处死小鼠，分离耳后淋巴结（增殖峰值时间）；研磨成单细胞悬液，过滤调整浓度至1×10⁶ cells/mL；加入³H-TdR（1μCi/mL），37℃培养18小时；收集细胞用液体闪烁计数器测cPm。

结果判定需结合三点：SI≥3为阳性；剂量反应关系——浓度升高SI应上升，若高浓度SI下降需排查细胞毒性；阳性对照有效性——设置DNCB（二硝基氯苯）作为阳性对照，若其SI<3则试验无效。

细胞毒性评估是补充：若高浓度组淋巴结细胞数量较对照组减少超50%，说明存在严重细胞毒性，需剔除该浓度数据。

LLNA在三方检测中的应用场景

化妆品原料检测是常见场景：企业引入新原料（如表面活性剂、香精）时，需LLNA证明SI<3才能备案，例如某植物提取物香精需通过LLNA验证无致敏性方可用于化妆品。

化学品注册方面，欧盟REACH法规要求产量超1吨/年的化学品需提交皮肤致敏数据，LLNA是首选；中国《新化学物质环境管理登记办法》也要求新化学物质开展LLNA测试，报告是企业获证必备材料。

医疗器械材料评估：接触皮肤的敷料、胶带需检测浸提液致敏性，三方机构将器械浸泡模拟体液提取成分，用LLNA评估风险。

监管抽查：市场出现致敏产品投诉时，监管部门委托三方机构用LLNA检测可疑成分，为行政处罚提供依据。

LLNA在三方检测中的质量控制要点

溶剂验证：预实验验证溶剂安全性，涂敷后观察是否有刺激，溶剂对照组SI需<2，否则更换溶剂（如丙酮/橄榄油是常用安全溶剂）。

动物质量：来自有生产许可证的供应商，提供SPF级合格证，实验前健康检查，剔除体重异常、皮肤破损个体。

操作标准化：用移液器准确量取受试物，匀浆器匀速研磨淋巴结确保细胞均匀，³H-TdR加入量精确，培养时间严格18小时，避免操作偏差。

数据溯源：记录所有细节（动物编号、涂敷时间、浓度、cPm值等），保存至少5年；每个浓度组≥5只动物，平行样本CV需<30%，确保重复性。

LLNA的局限性及三方检测中的应对策略

局限性包括：无法区分刺激性与致敏性（刺激性物质会非特异性增殖）；对前体致敏原（需代谢激活）检测能力有限；亲水性物质难穿透皮肤导致假阴性。

应对策略：刺激性物质需同时做Draize皮肤刺激试验，降低浓度后重测；前体致敏原结合代谢活化系统（如肝微粒体S9）模拟体内代谢；亲水性物质用封闭涂敷（塑料膜覆盖）增强渗透，或更换溶剂（如丙二醇）。

此外，三方机构需结合其他方法验证：LLNA阳性需补充GPMT确认，阴性但有潜在风险需用体外替代法（如h-CLAT细胞试验）进一步评估。