医疗检测

在三方检测机构的皮肤致敏性评价中，阳性对照物是保障试验可靠性的核心要素之一。它不仅用于验证试验系统的敏感性与有效性，更作为受试物致敏强度判定的基准，直接影响检测结果的准确性与法规符合性。因此，阳性对照物的科学选择与规范使用，是皮肤致敏测试流程中不可忽视的关键环节。

阳性对照物在皮肤致敏测试中的核心作用

皮肤致敏测试的目的是评估受试物诱导皮肤过敏反应的潜力，而阳性对照物的首要作用是验证试验系统的“有效性”——即该系统能否准确检测出已知致敏物的致敏性。例如，若某试验中阳性对照物未引发预期的过敏反应，说明试验系统可能存在问题（如动物状态不佳、操作失误），需重新验证。

其次，阳性对照物可排除“假阴性”结果的风险。受试物可能因剂量过低、溶剂选择不当等因素未表现出致敏性，而阳性对照物的正常反应能证明试验条件是“敏感”的，从而确认受试物的阴性结果是真实的，而非试验系统失效。

此外，阳性对照物是实验室间结果可比性的基础。不同三方机构使用相同的阳性对照物，可将各自的试验结果锚定在同一基准上，避免因试验系统差异导致的结果偏差，满足监管部门对“结果一致性”的要求。

阳性对照物选择的四大基本原则

代表性：需覆盖不同致敏强度（强、中、弱）的物质，以适配不同受试物的评价需求。例如，强致敏物二硝基氯苯（DNCB）适用于验证系统对强致敏物的检测能力，中致敏物甲苯二异氰酸酯（TDI）适用于中等强度致敏物的对比，弱致敏物对苯二胺则适合评估低致敏风险的受试物（如化妆品原料）。

稳定性：阳性对照物需具备稳定的物理化学性质，在保质期内不发生降解、聚合或活性丧失。例如，DNCB为固体结晶，稳定性佳，而TDI因挥发性强，需密封储存于低温环境，避免活性降低。

重现性：多次试验中应表现出一致的致敏效果。例如，某批次DNCB的致敏率应稳定在80%-90%之间，若连续两次试验致敏率差异超过15%，则该批次不可使用。

合规性：必须符合国际或国内法规的要求。例如，OECD Guidelines 406（豚鼠最大化试验）推荐的阳性对照物包括DNCB、TDI等，CFDA《化妆品安全技术规范》也明确将这些物质列为推荐的阳性对照物，选择非法规推荐物质需提供充分的验证数据。

常见阳性对照物的特性与适用场景

二硝基氯苯（DNCB）：强致敏物，致敏率高（通常≥85%），稳定性好，是最经典的阳性对照物。但其具有强毒性与致癌性，操作时需严格防护，适用于验证试验系统的强敏感性，或评估高风险受试物（如工业化学品）。

甲苯二异氰酸酯（TDI）：中强致敏物，挥发性强，需以凡士林为基质制备成膏剂使用（减少挥发）。适用于评估挥发性受试物（如涂料、胶粘剂原料）的致敏性，因其致敏机制与受试物更接近。

对苯二胺（PPD）：弱至中致敏物，是染发剂中的常见原料，代表性强。适用于化妆品、个人护理品原料的致敏性评价，因受试物与对照物的应用场景一致，结果更具参考价值。

肉桂醛：天然来源的中致敏物，提取自肉桂油，适用于评估天然提取物（如植物精油）的致敏性。其优势在于致敏机制与天然受试物更相似，避免因“来源差异”导致的结果偏差。

使用前的三大验证步骤

纯度验证：需通过高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）等方法检测纯度，确保杂质含量≤1%。例如，DNCB的纯度需≥98%，若杂质中含有二硝基苯（无致敏性），会稀释其活性，导致致敏率降低。

活性验证：通过预试验检测致敏率，确认其活性符合要求。例如，DNCB的预试验中，10只豚鼠需至少8只出现过敏反应（红斑、水肿），否则需调整剂量或更换批次。

批次一致性验证：对比同一物质不同批次的致敏效果，要求批次间致敏率的变异系数（CV）≤10%。例如，批次A的致敏率为88%，批次B为82%，CV=（88-82）/[(88+82)/2]=6.67%，符合要求。

剂量设计的关键要点

剂量范围：需覆盖阳性对照物的“致敏阈值”——即能引发过敏反应的最低剂量。例如，DNCB的致敏阈值约为0.05%（丙酮溶液），因此剂量范围通常设为0.1%-1%，既保证能引发反应，又避免因剂量过高导致动物死亡。

剂量梯度：至少设置3个梯度（如0.1%、0.5%、1% DNCB），以观察剂量-反应关系。若仅设置1个剂量，无法确认该剂量是否在有效范围内（如剂量过高可能导致毒性反应，而非过敏）。

溶剂选择：需兼容阳性对照物与试验系统。例如，DNCB脂溶性强，需用丙酮溶解；对苯二胺水溶性较好，可用生理盐水或丙二醇溶解；避免使用刺激性溶剂（如二甲苯），否则会混淆过敏反应与刺激性反应。

操作过程中的规范要点

给药方式：遵循试验方法的要求，例如豚鼠最大化试验中，诱导阶段需将阳性对照物涂于背部脱毛区，用铝箔封闭24小时（增强皮肤渗透），激发阶段则涂于腹部脱毛区（未接触过诱导剂量的皮肤）。

给药部位：选择无毛发、皮肤厚度一致的区域（如豚鼠背部或兔腹部），面积需固定（如2x2cm），避免因部位差异导致的吸收不一致。例如，背部皮肤较厚，吸收较慢，若改为耳部皮肤（较薄），会导致致敏率异常升高。

给药频率：严格遵循试验方案，例如OECD 406要求诱导阶段给药1次（封闭24小时），2周后进行激发给药（开放48小时）。若诱导次数增加，会导致致敏率虚高，影响结果准确性。

操作人员防护：针对有毒性的阳性对照物（如DNCB、TDI），需戴丁腈手套、护目镜，在通风橱内操作，避免皮肤接触或吸入。操作后需彻底清洁设备与双手，防止残留物质污染其他试验。

结果判定与阳性对照的关联规则

阳性对照的结果要求：试验有效性的前提是阳性对照物达到预期的致敏率。例如，OECD 406要求阳性对照的致敏率≥70%，若低于该值，试验无效，需重新进行。例如，某试验中DNCB的致敏率为65%，说明试验系统可能存在问题（如动物应激、溶剂选择错误），需排查原因后重试。

结果异常的处理：若阳性对照物的致敏率异常（过高或过低），需立即停止试验，检查以下因素：剂量是否准确（如称量误差）、溶剂是否变质（如丙酮挥发导致浓度升高）、动物状态（如是否感染皮肤病）、操作是否规范（如封闭时间不足）。

受试物与阳性对照的对比：受试物的致敏率需与阳性对照的梯度进行对比，以判定其致敏强度。例如，受试物的致敏率与0.5% DNCB（致敏率80%）相当，则判定为强致敏物；与0.1% DNCB（致敏率50%）相当，则为中致敏物；低于0.05% DNCB的致敏率，则为弱致敏或无致敏性。