医疗检测

体外重组皮肤模型是替代动物实验的重要工具，广泛用于化妆品、化学品的皮肤刺激测试。第三方检测机构作为独立评估方，需严格遵循标准化操作步骤，确保结果的准确性与可靠性。本文聚焦体外重组皮肤模型皮肤刺激测试的第三方检测实验流程，从材料准备到数据记录全环节展开详细说明。

实验材料与设备准备

第三方检测需优先选择经国际认证的重组皮肤模型，如EPiDermTM（人角质形成细胞构建的3D模型）或SkinEthic RHE（多层分化表皮），模型需符合OECD 439等指南要求。

试剂方面，需准备模型专用培养液（如EPiDerm SFM）、无钙磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）、MTT细胞活力检测试剂（0.5mg/mL溶于培养液）、5%十二烷基硫酸钠（SDS）阳性对照、PBS阴性对照。若做组织学检测，还需甲醛固定液、苏木精-伊红（HE）染色剂。

设备需提前调试：CO2培养箱设定37℃、5%CO2、95%湿度；生物安全柜进行无菌检测；酶标仪校准570nm波长；倒置显微镜用于观察模型形态。

重组皮肤模型的验收与预处理

模型送达后，先检查运输包装（干冰是否充足、温度≤10℃），再观察培养基颜色（正常为浅红色，变黄提示PH异常），通过显微镜查看模型：表皮完整、无裂隙，基底膜与支撑膜贴合紧密，无污染。

预处理时，将模型平衡至室温（30分钟），吸去表面运输培养液，加入2mL新鲜培养液（沿支撑膜边缘添加，避免冲散表皮），放入CO2培养箱预孵育24小时，使模型适应环境。

预孵育结束后，观察模型状态：表皮半透明、有光泽，培养液无浑浊，此时可进入受试物暴露环节。

受试物与对照品的制备

固体受试物（粉末、膏霜）需研磨成粒径≤100μm的细粉，避免颗粒损伤表皮；不溶于水的受试物可用二甲基亚砜（DMSO）溶解，但最终浓度≤0.5%（超过会干扰细胞活力）。

液体受试物（溶液、乳液）用培养液或PBS稀释至测试浓度（如原液、1:10稀释液），挥发性液体需在密闭容器中制备，防止成分流失。

阳性对照用5%SDS水溶液（OECD 439推荐），阴性对照为PBS。所有样品需无菌处理（滤膜过滤或高压灭菌），避免微生物污染。

受试物的暴露操作

暴露前，将模型从培养箱取出，置于生物安全柜内，用移液器轻轻吸去表面培养液（避免触碰表皮），确保受试物直接接触表皮。

固体受试物取10mg细粉，均匀铺在模型表皮中央（面积约0.64cm²，对应EPiDerm模型尺寸）；液体受试物取25μL滴加在表皮中央，避免流至模型边缘（边缘无表皮，会偏差）。

暴露时间按方法要求：急性刺激（OECD 439）为15分钟， Prolonged exPosure为4小时。暴露期间，模型需放回CO2培养箱，保持设定条件。

暴露后的清洗与孵育

暴露结束后，立即用PBS缓慢冲洗模型表皮（流速≤5mL/min），去除残留受试物，重复3次，确保无残留。

冲洗后，加入2mL新鲜培养液，放入CO2培养箱孵育24小时（修复期），让细胞代谢恢复，使活力变化更显著。

孵育期间，每6小时观察一次：若培养液浑浊或模型表皮破损，需记录异常并判断是否终止实验。

终点指标的检测与分析

细胞活力检测用MTT法：向模型加入1mL MTT试剂，37℃孵育4小时，吸去试剂后加1mL DMSO溶解甲瓒结晶（振荡10分钟），取200μL至酶标板，测570nm处OD值。

细胞活力计算公式：（受试物组OD值/阴性对照组OD值）×100%。按OECD 439标准，活力<50%为“皮肤刺激性”，≥50%为“非刺激性”。

组织学检测需将模型用10%甲醛固定24小时，石蜡包埋、HE染色后，显微镜观察：刺激性受试物会导致表皮裂隙、细胞水肿、核固缩；非刺激性受试物表皮结构完整。

实验过程的质量控制

预孵育后，模型细胞活力需≥90%；阴性对照组活力≥80%（确保模型无损伤）；阳性对照组活力≤50%（验证体系有效）。

操作需严格无菌：生物安全柜每实验日紫外线消毒30分钟，移液器、培养皿高压灭菌，实验人员戴无菌手套、口罩。

若出现模型污染、阴性对照活力<80%、阳性对照活力>50%、受试物涂抹不均，实验需重新进行。

数据记录与结果报告

实时记录操作细节：模型编号、收到日期、预孵育时间、受试物浓度、暴露时间、冲洗次数、孵育温度、OD值。记录保留至少5年，符合溯源要求。

结果报告需包含：实验方法（如OECD 439）、模型信息（来源、批次）、受试物信息（名称、浓度）、对照品结果（阳性/阴性活力）、受试物活力百分比、刺激性结论。

报告需加盖机构公章，附实验人员签名，确保权威性与可追溯性。