生物检测

临床腹水是肝硬化、恶性肿瘤、感染性疾病等的重要病理产物，其蛋白质组蕴含疾病诊断、机制研究的关键信息。LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）作为高灵敏度蛋白质组学技术，是腹水蛋白分离鉴定的核心工具。本文系统梳理其检测方案，覆盖样本前处理、蛋白提取、质谱检测全流程，为临床及科研提供实操参考。

临床腹水样本的收集与预处理

样本收集需用EDTA/肝素抗凝管，避免凝血；采集后4℃冷藏，1小时内3000g离心10分钟分离上清（去除细胞碎片）。若无法立即处理，上清分装为100μL/管，-80℃冻存，避免反复冻融（≤3次），防止蛋白变性。

预处理需去除高丰度蛋白与脂质：腹水中白蛋白、IgG占比超60%，用MARS Human 14亲和柱（去除14种高丰度蛋白）或10% PEG6000沉淀法富集低丰度蛋白；脂质用氯仿-甲醇法去除——1体积上清+4甲醇+1氯仿+3水，涡旋后12000g离心15分钟，取上层水相（含蛋白）。

腹水蛋白质的提取与定量

蛋白提取用尿素-硫脲液（8M尿素+2M硫脲+4% CHAPS）：100μL上清加500μL提取液，冰上孵育30分钟（每10分钟涡旋1次），15000g离心20分钟取上清。该液可破坏蛋白结构、增加溶解度，适合腹水蛋白提取。

定量用BCA法（不受去垢剂干扰）：蛋白溶液1:5稀释，与BCA工作液（50:1）混合后37℃孵育30分钟，测562nm吸光度，以BSA标准曲线算浓度（目标≥1mg/mL）。需调整每样本蛋白量一致（如100μg/管），保证实验重复性。

蛋白质的酶解与肽段纯化

酶解前还原烷基化：加DTT（终浓度10mM）56℃孵育30分钟（还原二硫键），冷却后加碘乙酰胺（20mM）室温避光30分钟（烷基化半胱氨酸，防止复键）。

用胰蛋白酶（1:50酶/蛋白比）37℃孵育12-16小时；或先Lys-C酶解4小时再胰酶解，提高覆盖率。酶解后用C18 ZipTip纯化：甲醇活化→0.1%甲酸平衡→上样→0.1%甲酸洗涤→80%乙腈+0.1%甲酸洗脱，真空干燥后用0.1%甲酸+1%乙腈复溶。

液相色谱的肽段分离优化

采用纳升液相色谱（nano-LC），色谱柱选C18反相柱（75μm内径×25cm长，1.9μm颗粒，10nm孔径）；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸+80%乙腈。

梯度洗脱程序：0-5min 2% B（平衡）；

5-95min 2%-35% B（线性分离肽段）；

95-100min 35%-95% B（洗脱强疏水肽段）；

100-105min 95% B（冲洗柱子）；

105-110min 回到2% B（重新平衡）。流速300nL/min，柱温35℃（保持柱效）。

MS/MS检测的参数设置

质谱仪选Orbitrap Fusion（分辨率≥70,000 FWHM），离子源为纳米电喷雾（nanoESI），喷雾电压2.0kV，毛细管温度320℃，鞘气/辅助气设为0（纳升流速无需鞘气）。

数据采集用DDA模式：一级全扫描（m/z 350-1500）分辨率70,000，AGC目标1e6，最大注入时间50ms；二级扫前20个强母离子，HCD碎裂（碰撞能量30%），分辨率17,500，AGC目标5e4，最大注入时间25ms，动态排除30s（避免重复扫描）。

质谱数据的质量控制

每批样本加BSA酶解肽段作质控，监测3指标：保留时间RSD<2%（色谱稳定）、肽段峰强度RSD<15%（信号一致）、鉴定蛋白数变异<10%（方法重复）。

质谱仪每日用ESI校准液校准，确保一级质量误差<5ppm、二级<10ppm。样本复溶后12000g离心5分钟，去除不溶物防堵柱。

蛋白质鉴定的数据库搜索

数据库选UniProt Human（无冗余），搜索引擎用MaxQuant。参数：胰蛋白酶（允许2个漏切），固定修饰为半胱氨酸羧甲基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化，一级质量容差±10ppm，二级±0.02Da。

鉴定标准：肽段FDR<1%（目标-诱饵数据库控制），蛋白质需至少2个独特肽段（或1个肽段且score≥40），确保假阳性率<1%。

鉴定结果的验证与可靠性

关键蛋白用Western Blot验证：选特异性抗体，检测病例组与对照组腹水的蛋白表达差异，结果需与质谱一致（如质谱显示上调，WB条带应增强）。

靶向验证用PRM（平行反应监测）：针对目标肽段设置离子对，定量精度达fg级，弥补DDA定性局限。若需确认细胞来源，结合免疫组化（IHC）检测腹水脱落细胞或原发病灶，验证蛋白定位。

可靠性分析需统计生物学重复相关性：3次重复的蛋白丰度Pearson系数≥0.85，鉴定蛋白数≥300种（临床腹水常规范围），动态范围≥5个数量级（覆盖高、中、低丰度蛋白）。