生物检测

临床血清样本是疾病诊断与生物标志物研究的核心材料，其蛋白质组包含大量生理病理信息，但高丰度蛋白（如白蛋白、IgG）占比超90%，低丰度蛋白（如肿瘤标志物、细胞因子）易被掩盖，需标准化技术方案实现精准分离鉴定。三方检测LC-MS/MS技术方案（临床机构、检测实验室、质谱平台协同）通过规范样本处理、优化分离参数、严格质量控制，成为血清蛋白质组研究的关键路径，可有效解决血清成分复杂、低丰度蛋白检测难等问题。

临床血清样本的预处理规范

样本采集需遵循临床标准：患者空腹8-12小时后，用无抗凝剂真空管采集静脉血，避免溶血（溶血会释放血红蛋白干扰结果）。采集后30分钟内于4℃、3000rpm离心10分钟分离血清，取上层血清立即分装至无酶EP管，-80℃冻存，禁止反复冻融（反复冻融会导致蛋白变性聚集）。

样本运输需用干冰维持-20℃以下，干冰重量需≥样本重量2倍，防止运输途中解冻。接收样本时需核对标签信息（患者ID、采集时间、冻存温度），不符合要求的样本应退回重新采集。

预处理前需进行蛋白定量，常用BCA法或Bradford法，要求蛋白浓度CV<5%，确保上样量一致（通常100-500μg蛋白）。对于微量样本（<50μL血清），可采用FASP法（滤膜辅助样本制备），将蛋白限制在超滤管内处理，减少样本损失。

样本解冻时需在冰上缓慢融化，融化后立即于12,000rpm、4℃离心10分钟，去除变性蛋白沉淀，取上清进行后续高丰度蛋白去除或酶解步骤。

高丰度蛋白质的去除策略

血清中高丰度蛋白（如白蛋白、IgG）会占据质谱动态范围，需优先去除。免疫耗竭法是最常用技术，通过偶联高丰度蛋白抗体的色谱柱（如Agilent MARS-14柱），可特异性去除14种主要高丰度蛋白，去除率达95%以上，显著提高低丰度蛋白鉴定数量。

免疫耗竭法的不足是可能丢失与高丰度蛋白结合的低丰度蛋白（如白蛋白结合的脂肪酸结合蛋白），因此需根据研究目的选择：若关注游离态低丰度蛋白，可采用此方法；若需检测结合态蛋白，可选择染料亲和色谱法（如Cibacron Blue F3GA柱），通过染料与白蛋白的疏水作用去除白蛋白，成本低但特异性稍差。

此外，分子筛色谱（SEC）可根据分子量分离高丰度大蛋白（如IgG，150kDa）与低丰度小蛋白（如细胞因子，<20kDa），但分离效率低、耗时久，仅适用于小样本量研究。

去除高丰度蛋白后，需用BCA法重新定量蛋白，确保后续酶解步骤的蛋白量一致。

蛋白质的酶解优化方案

酶解是将完整蛋白切成适合质谱检测的肽段（8-20个氨基酸）的关键步骤。首先进行还原与烷基化：用10mM DTT（二硫苏糖醇）在56℃还原30分钟，打破蛋白质二硫键；再用55mM IAM（碘乙酰胺）避光、室温烷基化30分钟，防止二硫键重新形成。

胰蛋白酶是首选蛋白酶，因其切割位点特异（Arg、Lys羧基端），产生的肽段适合质谱分析。酶解条件需优化：缓冲液为50mM NH4HCO3（pH8.0），酶与蛋白比例1:50或1:100（w/w），37℃孵育16小时（过夜酶解），确保酶解完全。

对于难酶解的蛋白（如跨膜蛋白、纤维蛋白原），可增加酶解时间至24小时，或采用两步酶解（先胰蛋白酶，再Lys-C），提高肽段覆盖率。微量样本可采用FASP法酶解，将酶解过程限制在超滤管内，减少肽段损失。

酶解完成后，需用真空离心浓缩仪将样本浓缩至10-20μL，加入0.1%甲酸水溶液复溶，过滤（0.22μm滤膜）去除杂质，准备上样。

液相色谱分离的参数设计

液相色谱（LC）的作用是按疏水性分离肽段，提高质谱分辨率。反相液相色谱（RPLC）是血清蛋白质组研究的金标准，固定相选择C18硅胶柱（如Thermo Easy-Spray C18柱，2μm粒径，75μm×50cm），流动相A为0.1%甲酸水溶液（增加肽段质子化，提高ESI离子化效率），流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液（提供疏水性洗脱能力）。

梯度洗脱方案需优化：初始0-5分钟保持5% B，让肽段充分保留；

5-45分钟线性增加至35% B，洗脱中等疏水性肽段；

45-50分钟快速增加至95% B，洗脱强疏水性肽段；

50-55分钟维持95% B，清洗柱子。流速设置为300nL/min（纳米LC），柱温40℃，提高分离度并减少肽段吸附。

预柱（如Thermo Acclaim PepMap 100 C18柱，5μm粒径，300μm×5mm）可去除样本中的盐和杂质，保护分析柱，延长使用寿命。样本量>10μg时，可选择150μm内径柱子，流速1μL/min；样本量<1μg时，用75μm内径柱子，流速300nL/min，避免肽段稀释。

分离完成后，肽段通过ESI离子源直接进入质谱，无需收集样本，减少损失。

质谱检测的参数优化

质谱（MS/MS）是鉴定肽段与蛋白质的核心设备，需优化离子源与扫描参数。电喷雾离子源（ESI）是血清蛋白质组的首选，适合纳米LC流速，可将液相肽段转化为气相离子。

一级质谱（MS1）参数：正离子模式，扫描范围350-1500m/z（覆盖血清大部分肽段分子量），分辨率70,000（at m/z 200），质量精度<5ppm（确保数据库搜索准确性）。

二级质谱（MS2）采用高阶碰撞解离（HCD），碰撞能量30%，产生丰富的b离子、y离子（用于肽段序列解析）。数据采集模式选择DDA（数据依赖采集）或DIA（数据非依赖采集）：DDA适合蛋白质鉴定（每次MS1扫描后选前20个最强峰做MS2，动态排除30秒）；DIA适合定量分析（将MS1范围分成10m/z窗口，对每个窗口内所有离子做MS2，覆盖更全面）。

质谱运行中需插入QC样本（如BSA酶解肽段），要求鉴定的肽段数CV<10%，FDR<1%，确保仪器稳定性。

三方检测的质量控制体系

临床机构端QC：样本采集后需标注“无溶血、无脂血”，冻存温度记录至-80℃，运输干冰重量达标。若样本溶血指数（HI）>200，需重新采集；HI在100-200之间，需在报告中注明“溶血可能影响结果”。

检测实验室端QC：前处理每步做平行样（n=3），蛋白定量CV<5%，酶解后用HPLC检测肽段分布（主峰应在10-30分钟内洗脱），确保酶解完全。高丰度蛋白去除后，需用SDS-PAGE验证去除效果（高丰度蛋白条带明显减弱）。

质谱平台端QC：每天开机用Thermo Pierce ESI校正液校正质量轴，用标准蛋白（BSA酶解肽段）做QC样本，要求鉴定肽段数稳定（CV<10%），FDR<1%。运行样本时，每10个样本插入1个QC样本，监控仪器状态。

三方需建立信息共享机制：临床机构提供患者基本信息（年龄、性别、诊断），检测实验室提供前处理记录（蛋白定量结果、酶解条件），质谱平台提供检测报告（蛋白列表、定量结果、QC数据），确保每一步可追溯。

数据处理与结果验证

数据处理常用MaxQuant（开源）或Proteome Discoverer（商业化）软件。以MaxQuant为例，设置参数：固定修饰为carbamidomethyl（C），可变修饰为oxidation（M）、acetylation（N端）；数据库选UniProt Human Reference Proteome；搜索后过滤条件：肽段FDR<1%，蛋白FDR<1%，至少2个独特肽段（提高可信度）。

定量分析采用Label-Free Quantitation（LFQ），通过肽段峰面积计算蛋白相对丰度，适合疾病组与对照组的差异分析。差异蛋白筛选条件：fold change>1.5或<0.67，P值<0.05。

结果验证需采用靶向方法：Western blot（检测蛋白表达水平，适合高丰度蛋白）或PRM（平行反应监测，适合低丰度蛋白）。PRM通过设置目标肽段的m/z、保留时间，针对性扫描，灵敏度比Western blot高10-100倍，可验证细胞因子、肿瘤标志物等低丰度蛋白。

生物信息学分析：用String数据库分析蛋白-蛋白相互作用（PPI），用DAVID数据库进行GO注释（分子功能、生物过程），用KEGG数据库分析信号通路（如PI3K-Akt、MAPK通路），揭示蛋白的生理病理意义。

低丰度蛋白质的富集策略

血清中低丰度蛋白（如PSA、CA125）是疾病诊断的关键生物标志物，需额外富集。免疫亲和富集是常用方法：用针对目标蛋白的抗体偶联磁珠（如抗PSA抗体磁珠），特异性捕获目标蛋白，富集倍数可达1000倍以上，适合临床检测。

固相萃取（SPE）用Oasis HLB柱（亲水亲脂平衡柱），富集疏水性低丰度肽段，操作简单，适合批量样本处理。纳米材料（如金纳米粒子、磁性纳米粒子）因比表面积大、吸附能力强，可高效富集低丰度蛋白，如金纳米粒子修饰抗体，富集效率比传统磁珠高5-10倍。

分子印迹聚合物（MIP）是新型富集材料，通过“印迹”目标蛋白的结构，形成特异性结合位点，可重复使用，适合长期监测同一目标蛋白（如糖尿病患者的胰岛素）。

富集后需用LC-MS/MS验证：目标蛋白的鉴定肽段数需≥2个，丰度比富集前提高10倍以上，确保富集效果。