医疗检测

GB/T 21608-2008《化学品 皮肤致敏试验 局部淋巴结试验：DA法》是我国评估化学品皮肤致敏性的核心国家标准，适用于化妆品原料、工业化学品、洗涤剂等产品的致敏性检测。三方检测机构作为独立第三方，需严格遵循该标准流程，为企业合规和监管决策提供客观、可溯源的致敏性数据支持。

GB/T 21608-2008的标准定位与适用范围

GB/T 21608-2008基于国际公认的“局部淋巴结试验（LLNA）”开发，采用DA法（Draining LymPh Node Assay）定量检测致敏原的免疫激活能力，是我国目前最敏感的皮肤致敏检测方法之一。标准适用于“可能与皮肤直接接触的化学品”，包括化妆品中的乳化剂、防腐剂，工业用表面活性剂，农药中间体等。需注意的是，标准不适用于已明确具有强致敏性的物质（如甲醛），此类物质无需重复检测，可直接参考已有数据。

标准同时强调“皮肤致敏”与“皮肤刺激”的区分：致敏是免疫介导的迟发型反应（接触后24-72小时出现），而刺激是直接的炎症反应（接触后数小时出现）。检测中需避免刺激干扰——若样品引起皮肤红肿、溃烂，需调整浓度后重新试验，防止刺激导致的假阳性结果。

皮肤致敏测试的核心原理：局部淋巴结试验DA法

LLNA:DA法的核心逻辑是“致敏原激活T淋巴细胞增殖”。当致敏原接触皮肤后，会被朗格汉斯细胞（皮肤内的抗原提呈细胞）摄取，迁移至背部引流淋巴结（如耳后淋巴结），将抗原呈递给T淋巴细胞。激活的T细胞会大量增殖，主动摄取胸腺嘧啶核苷（TdR）用于DNA合成。

试验通过掺入放射性同位素标记的3H-TdR（或非放射性的BrdU），定量检测淋巴细胞的增殖程度：增殖越旺盛，放射性强度（cPm值）或吸光度（OD值）越高。这种方法直接反映致敏原的免疫激活能力，相比传统豚鼠试验（观察皮肤红斑），减少了主观判断误差，且所需动物数量更少（每组4-5只小鼠），符合“3R”原则（减少、替代、优化动物试验）。

测试样品的要求与前处理规范

样品前处理是三方检测的关键环节，直接影响结果准确性。首先是“溶剂选择”：优先使用标准推荐的丙酮/橄榄油混合液（4:1）或生理盐水（水溶性样品）。若需用其他溶剂（如乙醇），需验证溶剂本身不会引起增殖（溶剂对照组SI<1.6），避免溶剂干扰。

其次是“浓度梯度设计”：样品需制备3-5个浓度，覆盖“无刺激浓度”至“最大耐受浓度”。例如，固体样品需粉碎溶解，液体样品直接稀释，确保每个浓度均为均一溶液（无沉淀、分层）。关键是找到“最大无刺激浓度（MIST）”——浓度过高会引起刺激，导致炎症性增殖，产生假阳性。

此外，样品稳定性需注意：易挥发样品（如乙醇溶液）需新鲜配制，易降解样品需检测活性成分含量，确保试验样品与实际产品一致。

三方检测的标准化流程解析

三方检测需严格遵循标准流程，确保结果可重复。具体步骤如下：

1、动物选择：选用6-8周龄雌性BALB/c或C57BL/6小鼠（SPF级），雌性激素水平稳定，对致敏原更敏感。

2、给药处理：试验前1天剃除背部皮肤（2×3cm），连续3天涂敷样品（0.02ml/只），对照组涂敷溶剂。

3、淋巴结采集：第5天处死小鼠，取双侧耳后淋巴结，去除脂肪，制备单细胞悬液。

4、增殖检测：悬液与3H-TdR共同培养18-24小时，用液体闪烁计数器测cPm值（或BrdU法测OD值）。

5、数据计算：刺激指数SI=试验组cPm/对照组cPm，SI是判定致敏性的核心指标。

结果判定的关键指标与临界值

标准中结果判定需结合“SI值”和“浓度-反应关系”：

1、SI临界值：SI≥1.6时判定为“致敏阳性”，SI<1.6为阴性。SI=1.6是统计上的95%置信区间，代表试验组增殖显著高于对照组。

2、浓度-反应关系：阳性结果需伴随“浓度升高，SI递增”（如1%浓度SI=1.8，5%浓度SI=3.2）。若高浓度SI反而下降，可能是样品毒性抑制增殖，需重新调整浓度。

3、刺激排除：若样品引起皮肤刺激（红斑评分≥2），即使SI≥1.6，也需降低浓度至无刺激后重测——刺激导致的炎症增殖与致敏增殖机制不同，需严格区分。

三方检测的质量控制要点

三方检测需从多环节控制质量，确保结果可靠：

1、动物房环境：SPF级动物房需控制温度（20-26℃）、湿度（40-70%）、光照（12h明/12h暗），避免环境应激影响结果。

2、试剂与设备：3H-TdR需有溯源证书，液体闪烁计数器定期校准（误差≤5%）；解剖器械无菌处理，防止交叉污染。

3、操作重复性：同一批次样品做平行试验（2次独立试验），结果偏差≤10%；不同操作人员的结果需一致，确保标准化。

4、数据记录：每一步操作（动物编号、给药时间、cPm值）需详细记录，原始数据保存至少5年，以便监管核查。

常见误区与结果解读的注意事项

结果解读需避免以下误区：

1、仅看SI值判定：若SI≥1.6但无浓度-反应关系（如低浓度SI=2.0，高浓度SI=1.5），需怀疑结果可靠性，可能是样品不均匀或操作误差。

2、忽略刺激干扰：样品引起皮肤刺激时，即使SI≥1.6，也不能直接判阳性——需降低浓度至无刺激后重测，区分刺激与致敏。

3、误用动物品系：标准推荐BALB/c或C57BL/6小鼠，若用其他品系（如ICR），需验证其对致敏原的敏感性（阳性对照SI≥3.0），避免品系差异导致假阴性。

4、混淆“致敏潜力”与“实际风险”：SI≥1.6仅说明样品有致敏潜力，实际风险需结合产品使用场景（如接触频率、面积）评估。例如，化妆品原料的致敏性需结合添加量（如0.1%）判断实际风险，而非直接等同于“有害”。